气相色谱直接进样法与顶空进样法测定白酒中甲醇的比较

罗玥，成桂红，钟红霞，王健，徐跃成

（四川省食品药品检验检测院，四川成都610100）

气相色谱直接进样法与顶空进样法测定白酒中甲醇的比较

罗玥，成桂红，钟红霞，王健，徐跃成

（四川省食品药品检验检测院，四川成都610100）

该实验对气相色谱直接进样法与顶空进样法测定白酒中甲醇的方法进行比较。直接进样法测定按GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准的方法分析》进行，并对色谱条件进行了改进及优化；顶空进样法测定时，对取样量、加热温度进行优化，建立最佳色谱条件。两种方法的线性范围为0.032～1.288 g/L，线性相关系数R均＞0.999。直接进样法的检出限为0.04 g/L，加标回收率为90%～110%，相对标准偏差（RSD）＜1%，方法不确定度结果为（0.166±0.012）g/L；顶空进样法的检出限为0.02 g/L，加标回收率范围为90%～110%，相对标准偏差（RSD）＜3%，方法不确定度结果为（0.160±0.012）g/L。以两种方法测定市售20种白酒样品，测定结果经配对t检验，无显著性差异（P＞0.05）。直接进样法无前处理过程，简单快速精密度高；顶空进样法检出限更低，灵敏度更高。

气相色谱直接进样；顶空进样；甲醇；白酒

甲醇是一种无色透明、易挥发性液体，在人体内代谢产物为甲醛、甲酸，有很强的毒性，尤其对视神经损害严重，误饮过量的甲醇会引起失明或中毒死亡[1-5]。白酒是以粮谷、薯类、水果、乳类等为主要原料，经发酵、蒸馏、勾兑而成的饮料酒，白酒中少量的甲醇可构成白酒不同的风格，过量则有害健康。目前，甲醇的检测方法有比色法、滴定法、生物传感器法、液相色谱法、气相色谱法，气相色谱法是世界上公认的测定酒中甲醇的方法[6]。GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准的方法分析》中甲醇的测定方法有比色法和气相色谱直接进样法[7]，比色法操作繁琐、费时[8]，气相色谱法采用填充柱恒温进样，对成分复杂的白酒分离效果差[9]。本实验拟选用毛细色谱柱对气相色谱直接进样法和顶空进样法分别进行色谱条件优化，用最佳色谱条件分别进行方法学验证，目的是便于选择白酒中甲醇含量测定的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙醇（色谱纯）：天津四友精细化学品有限公司；甲醇色谱标样（纯度为99.5%）：天津市化学试剂研究所；超纯水（电导率为18.2MΩ）：M illi-Q超纯水机制备；20种白酒（编号为1#～20#）：市售。

取色谱纯乙醇用超纯水配制成体积分数60%的乙醇溶液，用作溶剂及试剂空白；标准储备液的配制：取1m L甲醇色谱标样称质量为0.805 0 g，用体积分数60%乙醇溶液定容至50m L，得16.1 g/L甲醇标准储备液，备用。标准使用液的配制：分别准确吸取标准储备液0.02m L、0.05m L、0.10m L、0.20m L、0.40m L、0.80m L于10m L容量瓶中，用体积分数60%乙醇溶液定容至10m L，现用现配。

1.2 仪器与设备

7890B气相色谱仪（gas chromatography，GC）配氢火焰检测器（flame ionization detector，FID）及OpenLAB工作站、7697A顶空（Headspace，HS）自动进样器、HP-INNOWAX毛细色谱柱（30m×0.32mm×0.50μm）、HP-INNOWAX毛细色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）、CP-WAX57CB色谱柱（50m×0.25mm×0.20μm）：美国安捷伦科技有限公司；2010plus气相色谱仪配氢火焰检测器（flame ionization detector，FID）及GCsolution工作站：日本岛津公司；M illi-Q超纯水机：密理博中国有限公司；XS105电子天平：瑞士METTLERTOLEDO集团；吉尔森移液器（100～5000μL）：法国GILSON公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

（1）直接进样法

AgilentCP-wax57CB色谱柱；程序升温：30℃保持8m in，以2℃/m in升至70℃，保持1min，再以50℃/min升至190℃，保持4m in；进样口温度：220℃；检测器温度：280℃；分流比：50∶1；柱流速：0.80m L/min；定量方法：外标法；进样体积：0.5μL。

（2）顶空进样法

AgilentHP-INNOWAX色谱柱；程序升温：40℃保持8m in，以5℃/m in升至100℃，不保持，再以40℃/m in升至180℃，保持4min；进样口温度：220℃；检测器温度：250℃；分流比：60∶1；柱流速：1m L/m in；定量方法：外标法；进样体积：1m L；顶空自动进样器条件：加热箱90℃，定量环100℃，传输线110℃，样品瓶平衡时间20m in，进样持续时间：0.5min，进样循环36min。

1.3.2 测定步骤

直接进样法取混匀的标准使用液及酒样约1m L于进样小瓶，待测；顶空进样法准确取混匀的标准使用液及酒样各2m L于20m L顶空瓶中，压紧瓶盖，待测。待仪器工作正常且稳定后，依次对标准使用液各浓度梯度、空白、加标回收、样液进行测定。

2 结果与分析

2.1 直接进样法色谱条件优化

甲醇沸点为64.7℃[10]，选择气化温度80℃、90℃、100℃、120℃、150℃、200℃、220℃，程序升温条件：40℃保持5m in，以5℃/min速率升至200℃，保持1min，检测器：280℃，分流比：40∶1，进样体积：0.5μL，在此条件下对甲醇标品定性并比较峰面积，结果表明，气化温度不低于150℃时，甲醇峰峰面积趋于稳定且峰形好，因此选择150℃作为进样口温度。但是对于成分比较复杂的白酒样品时会发现甲醇峰和其他峰包裹的现象，继续做了如下优化：选择进样口温度220℃，检测器280℃条件不变情况下，分别对初始柱温保持时间、初始柱温、初始柱温保持时间、柱流速、程序升温速率、分流比、进样量进行一系列优化试验[11-13]，确定直接进样法测白酒中甲醇的色谱条件为：进样体积0.5μL，进样口温度220℃，柱流速0.8m L/m in，分流比50∶1，程序升温30℃保持8m in，以2℃/min升至70℃，保持1m in，再以50℃/m in升至190℃，保持4m in。此条件下甲醇峰峰形好，白酒样品中甲醇峰的分离度为1.268，直接进样法甲醇标准溶液色谱图及白酒样品色谱图见图1。

图1 直接进样法甲醇标准溶液（A）及白酒样品（B）色谱图Fig.1 Chromatogram ofm ethanolstandard so lution(A)and Baijiu sample(B)by direct injection

2.2 顶空进样法色谱条件优化

2.2.1 HP-INNOWAX毛细色谱柱优化

HP-INNOWAX色谱柱的最低使用温度为40℃，初始温度40℃不变的情况下，对初始温度保持时间、柱流速、程序升温速率、分流比、进样量参照直接进样法进行优化，甲醇峰不能得到理想的优化条件，于是考虑换用HP-INNOWAX色谱柱，在上述优化条件下继续优化，得到顶空进样的最佳色谱条件：程序升温为40℃保持8min，以5℃/min升至100℃，不保持，再以40℃/min升至180℃，保持4min；进样口温度：220℃；检测器温度：250℃；分流比：60∶1；柱流速：1m L/m in；顶空自动进样器条件：加热箱90℃，定量环100℃，传输线110℃，样品瓶平衡时间20m in，进样持续时间0.5m in，进样循环36m in。

2.2.2 样品瓶加热温度及取样量优化

因为甲醇沸点为64.7℃，样品瓶加热温度分别设为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃进行试验，60℃、70℃响应值较小，100℃有拖尾峰，因此确定90℃为最佳样品瓶加热温度。样品瓶中分别取1m L、2m L、3m L、4m L、5m L进行试验。结果表明，进样量不低于2m L时甲醇峰峰面积几乎无变化，确定标准溶液及样品取样量为2m L。在此优化条件下，测得白酒样品中甲醇峰分离度为2.82，顶空进样法甲醇标准溶液色谱图及白酒样品色谱图见图2。

图2 顶空进样法甲醇标准溶液（A）及白酒样品（B）色谱图Fig.2 Chromatogram ofm ethanolstandard so lution(A)and Baijiu sample(B)by headspace injection method

2.3 线性范围、相关系数及检出限的比较

分别用两种方法测定配制的甲醇标准使用液系列浓度，两种方法的标准曲线线性范围、相关系数及检出限结果见表1。

表1 直接进样法与顶空进样法的线性范围、相关系数及检出限Table 1 Linear range,correlation coefficient and detection lim it of direct injection m ethod and headspace injection method

由表1可知，两种方法得到线性范围0.0322～1.288g/L，以甲醇含量（X，g/L）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标的甲醇标准曲线回归方程相关系数R均0.999。表明两种方法均有良好的线性关系，优化后的直接进样法检出限（0.04g/L）高于顶空进样法检出限（0.02 g/L）。

2.4 精密度实验

取16.1 g/L甲醇标准储备液0.25m L用阴性样品定容至25m L，混匀后分别用两种方法进行精密度考察（平行实验6次），结果见表2。

表2 直接进样法与顶空进样法的精密度比较Tab le 2 Com parison of precision of direct in jection m ethod and headspace injection method

由表2可知，直接进样法相对标准偏差（relativestandard deviation，RSD）＜1%，顶空进样法RSD＜3%，顶空进样法更接近真值，精密度符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的技术要求[14]。

2.5 回收率实验

选择加标质量浓度0.048 g/L、0.161 g/L、0.483 g/L三个不同质量浓度水平对3个不同酒样进行加标实验，考察两种方法的准确度，结果见表3。

表3 两种方法加标回收率结果Tab le 3 Adding standard recovery results of two methods

由表3可知，两种方法的加标回收率为90%～110%，表明两种方法准确度较好。

2.6 样品测定

取20种市售白酒分别用两种方法进行测定，结果见表4。

表4 两种方法测定20种白酒中甲醇结果比较Table 4 Comparison of the results of the methanol content determ ination by two m ethods

由表4可知，两种方法测定结果经配对t检验，t=1.068，两种方法测定白酒中甲醇无显著性差异[15]（P＞0.05）。

2.7 不确定度比较

按标准曲线外标法计算白酒试样中甲醇含量，计算公式如下：

式中：X为白酒中甲醇含量，按100%酒精度折算，g/L；C为由标准曲线计算出进样液中甲醇含量，g/L；B为实测酒精度，%vol；100为按100%酒精度换算[16]。

通过计算公式建立数学模型，不确定度评定步骤如下：①根据6次平行测定结果计算A类相对标准不确定度②B类不确定度由甲醇色谱标样、实测酒精度、仪器引入相对标准不确定度[17-19]。通过合成计算得到不确定度结果见表5。

表5 两种方法的不确定度结果Table 5 Uncertainty rep resentation results o f two m ethods

由表5可知，直接进样法的方法不确定度结果为（0.166±0.012）g/L；顶空进样法的方法不确定度结果为（0.160±0.012）g/L。

2.8 再现性实验

实验室内不同时间不同人员进行再现性实验，选择0.03 g/L、0.09 g/L两个质量浓度进行6次加标实验，结果见表6。

表6 再现性实验结果Table 6 Results of reproducibility experiments

由表6可知，精密度和回收率范围均能满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中的技术要求，说明两种方法再现性好。

3 结论

本实验通过气相色谱直接进样法和顶空进样法分别从条件优化到方法学验证比较，结果表明，两种方法各项指标都能满足实验室要求。两种方法的线性范围为0.032 2～1.288 0 g/L，线性相关系数R均＞0.999。直接进样法的检出限为0.04 g/L，加标回收率为90%～110%，相对标准偏差（RSD）＜1%，方法不确定度结果为（0.166±0.012）g/L；顶空进样法的检出限为0.02 g/L，加标回收率范围为90%～110%，相对标准偏差（RSD）＜3%，方法不确定度结果为（0.160±0.012）g/L。以两种方法测定市售20种白酒样品，测定结果经配对t检验，无显著性差异（P＞0.05）。直接进样法无前处理过程，简单快速精密度高；顶空进样法检出限更低，灵敏度更高。两种方法各有优点，可灵活运用于白酒中甲醇含量的测定。

[1]申科敏，胡晓琴.顶空进样-毛细管柱气相色谱法测定酒中甲醇的含量[J].食品与药品，2016，18（5）：358-360.

[2]黄鸣，刘江勋，黎锡流.顶空气相色谱法测深色酒中微量甲醇[J].食品科学，2002，23（2）：106-108.

[3]陈捷敏.甲醇中毒视网膜功能结构和蛋白质组学研究[D].上海：复旦大学，2012.

[4]李莹.白酒中甲醇分析方法的研究[J].酿酒，2010，37（2）：77-78.

[5]张明赞，何腊平，张义明.白酒中甲醇、甲醛、氰化物和金属离子的研究进展[J].食品安全质量检测，2015，6（9）：3563-3568.

[6]WANGM L,WANG JT,CHOONG Y M.A rapid and accuratemethod for determ ination ofmethanol in alcoholic beverage by direct injection capillarygas chromatography[J].J Food Compos Anal,2004,17:187-196.

[7]中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.48—2003蒸馏酒与配制酒卫生标准的方法分析[S].北京：中国标准出版社，2003.

[8]张钟，陈海蓉.影响荔枝酒甲醇含量的因素[J].中国酿造，2014，33（3）：125-127.

[9]彭黎旭，刘洪升，王明月.气相色谱高温法快速测定酒中甲醇、杂醇油、乙酸乙醋和酒度[J].热带农业科学，1997（3）：41-45

[10]徐万秀.毛细管白酒专用柱气相色谱法测定白酒中甲醇含量[J].上海计量测试，2014（5）：27-29.

[11]李超豪，胡强，吴蔚，等.气相色谱法同时测定白酒中甲醇和乙（己）酸乙酯[J].食品与机械，2013，29（1）：81-87.

[12]亓学奎，王欣欣，杨华.毛细管色谱法测定白酒中的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯和正丙醇[J].食品科技，2014，39（2）：276-278.

[13]莫国荣.程序升温毛细管气相色谱法测定白酒中甲醇和杂醇油[J].中国卫生检验杂志，2012，22（2）：229-230.

[14]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 27404—2008实验室质量控制规范食品理化检测[S].北京：中国标准出版社，2008.

[15]郭爱华，袁佗，王玮，等.气相色谱法和离子色谱法测定饮料中甜蜜素的方法比较[J].现代预防医学，2015，42（11）：1975-1978.

[16]中华人民共和国卫生部.GB 2757—2012，食品安全国家标准蒸馏酒及其配制酒[S].北京：中国标准出版社，2013.

[17]刘忠，陈涛.蒸馏酒中甲醇测量结果不确定度分析[J].医学信息，2010，23（5）：1498-1499.

[18]侯凤仙，宁霞，黄爱华.气相色谱法测定白酒中甲醇的不确定度评估[J].预防医学，2014，10（5）：38-39.

[19]黄丽金，童优芸，袁勇军.气相色谱法测定白酒中甲醇含量测量结果不确定度的评定[J].安徽农业科学，2013，41（13）：5952-5953.

Comparison of direct injection and headspace injectionmethod in determ ination ofmethanol in Baijiu

LUO Yue,CHENGGuihong,ZHONG Hongxia,WANG Jian,XU Yuecheng
(Sichuan Institute ofProductQuality Supervision&Inspection,Chengdu 610100,China)

Themethanol determinationmethod in Baijiu was compared between the direct injectionmethod and headspace injectionmethod.The direct injectionmethod was conducted according to GB/T 5009.48—2003 by directsampling,and the chromatographic conditionswere improved and optimized.When thesamplesweremeasured bymethanolheadspacemethod,the sample volume,heating temperaturewasoptim ized and theoptimal chromatographic condition wasestablished.The linearity of twomethods ranged from 0.032 g/L to 1.288 g/L.The detection lim itof direct injection method was0.04 g/L,the adding standard recovery rate rangewas90%-110%,relative standard deviation(RSD)＜1%,and the resultsuncertainty of themethod was(0.166±0.012)g/L.The detection limitof headspacemethod was0.02 g/L,theadding standard recovery rate rangewas90%-110%, RSD＜3%,and the resultsuncertainty of themethod was(0.160±0.012)g/L.Twomethodswere used to determine the 20 kindsof Baijiu samples,the resultswere analyzed by paired t test,and therewasno significantdifference(P＞0.05).The direct injectionmethod had no pretreatmentprocess,it wassimple and rapid w ith high precision,low sensitivity.The detection lim itofheadspacemethod was lower,and the sensitivitywashigher.

gas chromatography directinjection;headspace injection;methanol;Baijiu

O657.7

0254-5071（2017）08-0161-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.035

2017-02-27

罗玥（1986-），女，工程师，本科，主要从事食品检验方面的工作