北五味子多糖对中性粒细胞炎性因子白细胞介素- 6及细胞凋亡的影响

李洪涛 李嘉仪 王春梅 陈建光 孙晓红

(北华大学基础医学院，吉林 吉林 132013)

北五味子多糖对中性粒细胞炎性因子白细胞介素- 6及细胞凋亡的影响

李洪涛 李嘉仪1王春梅2陈建光2孙晓红

(北华大学基础医学院，吉林 吉林 132013)

目的 探讨北五味子多糖对脂多糖(LPS)处理的中性粒细胞炎性因子白细胞介素(IL)- 6含量及细胞凋亡的影响。方法 实验分为空白对照组、LPS组及北五味子多糖组，使用酶联免疫吸附法(ELISA) 检测LPS处理的中性粒细胞的IL- 6含量及原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡。结果 北五味子多糖可以抑制IL- 6的分泌，随浓度的增加抑制作用增强，与LPS组相比，随时间延长抑制作用增强，16 h抑制作用最好，与LPS组相比IL- 6的含量显著降低(P<0.05)。LPS可使中性粒细胞凋亡延迟，作用16 h，LPS组凋亡指数与对照组相比显著降低(P<0.05)；北五味子多糖组凋亡指数随时间延长和浓度增加而增加，5 mg/ml北五味子多糖作用16 h促凋亡作用最好，与LPS组相比显著升高(P<0.05)。结论 北五味子多糖可减少LPS处理的中性粒细胞IL- 6的含量，并可促进中性粒细胞凋亡。

北五味子多糖；中性粒细胞；白细胞介素(IL)- 6；凋亡指数

五味子是我国的传统中药，有益气生津、收敛固涩、补肾宁心等功效〔1〕。我国五味子属有20余种，最常用的是北五味子，其次是华中五味子。五味子中含有木脂素、多糖、挥发油和氨基酸等成分〔2〕。北五味子多糖具有保肝、抗疲劳、增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用。近年研究发现多糖，如寡糖特别是果聚寡糖也具有抗炎作用〔3,4〕。还有一些寡糖及多糖的口服或外用消炎药正在临床试验中，因此，从多糖中筛选抗炎药物引起广泛重视〔5〕。中性粒细胞是介导炎症反应的重要效应细胞，在机体非特异性免疫防御中起重要作用。但在严重创伤、脓毒血症、缺血再灌注等条件下，中性粒细胞过度激活、释放大量毒性介质及产生大量的炎性细胞因子，炎性细胞因子又可延迟中性粒细胞凋亡，造成更多炎性细胞因子释放。此时抑制中性粒细胞过强的效应或促进其凋亡则有利于减轻机体损伤。本研究通过脂多糖(LPS)刺激人中性粒细胞的体外实验，探讨北五味子多糖对中性粒细胞白细胞介素(IL)- 6及凋亡延迟的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 北五味子多糖(东北师范大学生命科学院提供)；LPS(Sigma公司)；人中性粒细胞分离液(天津灏洋生物公司)；IL- 6检测试剂盒(RD公司)；原位末端标记法(TUNEL)检测试剂盒(罗氏公司)。

1.2 中性粒细胞分离及培养 采取健康志愿者外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。按人中性粒细胞分离液试剂盒、血液样本量小于5 ml进行操作。取15 ml离心管，先加入试剂A，后加入试剂B，制成梯度界面；小心吸取血液样本加入分离液之液面上，1 730 r/min离心30 min；吸取下层乳白色环置于另一15 ml离心管中(离心管中先加入清洗液5 ml)然后补足清洗液至10 ml，混匀细胞，1 160 r/min离心12 min，弃上清；5 ml清洗液重悬细胞，1 160 r/min离心12 min，弃上清；5 ml清洗液重悬细胞，1 160 r/min离心12 min，弃上清；加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液重悬液体，并将此液体倒入25 ml细胞培养瓶中，37℃、5%二氧化碳(CO2)培养。通过台盼蓝排斥实验计数并评价细胞存活率(>96%)。瑞士姬姆萨染色观察中性粒细胞纯度(>96%)。

1.3 实验分组 实验分为对照组、LPS组(终浓度1.0 μg/mL)、北五味子多糖组(LPS+北五味子多糖)，北五味子多糖终浓度为1.25 mg/ml、2.5 mg/ml、5 mg/ml。其中北五味子多糖组先加入LPS(终浓度1.0 μg/ml)刺激60 min，再加入北五味子多糖。每组设定3个平行孔。

1.4 酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL- 6含量 中性粒细胞悬液按1×105个细胞/ml接种于96孔平底培养板，在不同时间终止培养后，取各组细胞培养上清液1 500 r/min离心10 min；取40 μl离心上清液，加入对应的酶标板中。然后按IL- 6检测试剂盒进行操作。

1.5 TUNEL法检测中性粒细胞的凋亡 中性粒细胞悬液按2×106个细胞/ml接种于24孔平底培养板，在不同时间终止培养后，取细胞培养液涂片；固定液15℃～25℃风干1 h；磷酸缓冲液(PBS)冲洗玻片3次；封闭液15℃～25℃孵育10 min；PBS冲洗玻片3次；用渗透液孵育2 min、置于冰上2℃～8℃；PBS冲洗玻片2次，使样品周围区域变干；加入50 μl TUNEL反应混合液于样品上；在湿盒、暗室中加盖孵育60 min、37℃；PBS冲洗3次；可在样品上加入1滴PBS，于荧光显微镜下观察。在515～565 nm(绿色)范围内检测。凋亡细胞呈深绿色荧光，正常细胞不染色。计算凋亡指数，即凋亡细胞数/全部细胞数。

1.6 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件进行t检验和方差分析。

2 结 果

2.1 瑞士姬姆萨染色观察中性粒细胞形态 分离出的中性粒细胞状态好，典型分叶核状，细胞质红染，着色均匀。见图1。

2.2 ELISA法检测IL- 6含量 LPS可使中性粒细胞培养上清液中IL- 6的含量增加，且随时间延长促进分泌作用增强。LPS组IL- 6含量与对照组比显著升高(P<0.05)。北五味子多糖可以抑制IL- 6的分泌，随浓度增加抑制作用增强，与LPS组相比，随时间延长抑制作用增强。其中，北五味子多糖组作用16 h抑制作用最好；与LPS组相比，IL- 6含量显著降低(P<0.05)。见表1。

2.3 TUNEL法检测中性粒细胞的凋亡及凋亡指数 LPS组凋亡细胞数量减少，说明LPS可使中性粒细胞存活时间延长，凋亡延迟；北五味子多糖组的凋亡细胞数量增多，说明北五味子多糖可促进凋亡延迟的中性粒细胞凋亡。见图2。LPS组与对照组比中性粒细胞凋亡指数显著降低(P<0.05)。不同浓度北五味子多糖组的凋亡指数随时间延长和浓度增加而增加。其中，5 mg/ml北五味子多糖作用16 h促进凋亡作用最好，与LPS组相比显著升高(P<0.05)。见表1。

图1 中性粒细胞形态(瑞士姬姆萨染色，×400)

组别IL-6(pg/ml)2h4h8h16h凋亡指数(%)2h4h8h16h对照组2.62±0.182.98±0.213.02±0.243.29±0.293.62±0.396.62±0.3919.38±1.8935.52±3.68LPS组15.19±1.571)54.32±6.781)87.15±10.231)173.21±14.291)2.19±0.784.08±0.817.32±0.981)11.15±1.791)北五味子多糖组(1.25mg/ml)10.28±2.3431.91±3.5635.5±3.7859.85±4.532)3.17±0.954.38±0.987.95±1.2618.71±2.03北五味子多糖组(2.5mg/ml)8.67±1.5623.34±2.1327.53±2.562)38.89±3.152)3.42±0.595.67±0.8713.34±3.0829.53±3.752)北五味子多糖组(5.0mg/ml)4.59±0.538.63±0.982)11.28±0.872)13.36±0.892)3.57±1.756.98±1.8320.63±3.562)34.28±3.992)

与对照组比较:1)P<0.05；与LPS组比较:2)P<0.05

图2 中性粒细胞的凋亡形态(TUNEL法，×200)

3 讨 论

目前，以中性粒细胞浸润为特征的非特异性炎症，与哮喘、类风湿关节炎、溃疡性结肠炎、急性肺损伤、动脉粥样硬化、肾小球肾炎等多种疾病有关。当机体受到外界刺激时，可产生与免疫应答及炎症密切相关的多种细胞因子，如IL- 1β、IL- 6、肿瘤坏死因子(TNF)- α等。在众多自身免疫性疾病中，如类风湿关节炎、溃疡性结肠炎等，IL- 1β、IL- 6 及TNF- α 的水平也明显升高〔6,7〕。其中，IL- 6是炎性反应的促发剂，可以激活中性粒细胞胞内酶并促使细胞毒性颗粒释放，延迟中性粒细胞自发性凋亡等〔8〕。因此抑制中性粒细胞的凋亡延迟及细胞因子转录，对非特异性炎症的治疗具有重要意义。临床上应用的肾上腺皮质激素类与非甾体类治疗非特异性炎症，只能缓解症状且毒副作用大。我国中药资源丰富，中药属于天然产物且毒副作用小，已知的生物碱、黄酮、萜类、多糖及挥发油等均具有抗炎作用。其中，多糖是重要的生物活性物质，且从植物中提取的多糖最为重要。因此，从植物多糖中筛选抗炎药物具有重要价值。

本研究结果表明，LPS可使中性粒细胞存活时间延长，分泌IL- 6增加，IL- 6增加可使中性粒细胞凋亡延迟，中性粒细胞凋亡延迟又导致分泌IL- 6，这样形成了级联式瀑布效应，中性粒细胞过度浸润、存活时间延长，加重非特异性炎症反应。北五味子多糖可使LPS刺激的中性粒细胞的IL- 6减少，也对中性粒细胞的凋亡延迟起抑制作用，所以北五味子多糖有望成为新的抗非特异性炎症药物。

1 国家药典委员会.中华人民共和国药典〔M〕.北京:化学工业出版社,2005:44.

2 黄 鑫,宋凤瑞,刘志强,等.现代质谱及其联用技术在中药五味子研究中的应用〔J〕.世界科学技术- 中医药现代化,2009;11(1):115- 9.

3 Lindsay JO，Whelan K，Stagg AJ，etal.Clinical,microbiological,and immunological effects of fructo- oligosaccharide in patients with Crohn′s disease〔J〕.Gut，2006;55(3)：348- 55.

4 Guzmán S，Gato A，Lamela M，etal.Anti- inflammatory and immunomodulatory activities of polysaccharide from Chlorella stigmatophora and Phaeodactylum tricornutum〔J〕.Phytother Res，2003;17(6):665- 70.

5 Pereda- Miranda R，Kaatz GW，Gibbons S.Polyacylated oligosaccharides from medicinal Mexican morning glory species as antibacterials and inhibitors of multidrug resistance in Staphylococcus aureus〔J〕.J Nat Prod，2006;69(3):406- 9.

6 Jazayeri JA,Carroll GJ,Vernallis AB.Interleukin- 6 subfamily cytokines and rheumatoid arthritis:role of antagonists〔J〕.Int Immunopharmacol,2010;10(1):1- 8.

7 仲人前.细胞因子与自身免疫性疾病的关系〔J〕.中华检验医学杂志,2000;23(4):200- 2.

8 Ottonello L,Frumento G,Arduino N,etal.Differential regulation of spontaneous and immune complex- induced neutrophil apoptosis by proinflammatory cytokines.Role of oxidants,Bax and caspase- 3 〔J〕.J Leukoc Biol,2002;72 (1):125- 32.

〔2016- 11- 25修回〕

(编辑 王一涵)

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(2014201)；北华大学省级大学生创新创业训练计划项目(2016- 199100282);北华大学博士启动基金(199500031)

孙晓红(1968- )，女，博士，副教授，主要从事病原生物学及中药开发研究。

李洪涛(1969- )，男，高级实验师，主要从事法医病理学研究。

R285.5

A

1005- 9202(2017)15- 3687- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.019

1 北华大学第一临床医学院 2 北华大学药学院