白屈菜总碱对舞毒蛾离体酶活性的影响

吕春鹤，张国财，邹传山

(东北林业大学，哈尔滨150040)

白屈菜总碱对舞毒蛾离体酶活性的影响

吕春鹤，张国财*，邹传山

(东北林业大学，哈尔滨150040)

通过对白屈菜粗提物纯化获得白屈菜总碱，对舞毒蛾3龄幼虫5种离体酶活进行测定。测定结果表明：用AB-8大孔吸附树脂纯化白屈菜粗提物，得到5种生物单碱，含量从高到低依次为：黄连碱>白屈菜碱>盐酸小檗碱>血根碱>四氢黄连碱。纯化后的白屈菜总碱对5种离体酶活均有不用程度的抑制作用，对GST抑制作用最强，IC50为5.333 mg/mL，对CarE的抑制作用最弱，IC50为3.475×103mg/mL。白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫5种离体酶的敏感性依次为GST>AChE>CAT>SOD>CarE。

白屈菜；舞毒蛾；生物碱；离体酶活

随着化学农药的不断开发，越来越多的农药产品被投入到市场当中，造成了市场上化学农药的所占比例一直居高不下。近几十年来随着昆虫抗药性的增强，化学农药也在不断升级发展，最终导致化学农药的大量累积而且难被分解，使人们健康受到威胁。新型、无公害农药的研制、开发就成为了发展的必然[1]。因此，植物源农药受到了越来越多的关注，在植物源杀虫剂上应用广泛的生物碱包括烟碱、苦参碱、雷公藤碱、小檗碱等，这些生物碱都已被证明具有很好的杀虫活性[2]。

白屈菜(ChelidoniummajusL.)是罂粟科白屈菜属植物，全草入药、有毒。 白屈菜中所含的生物碱主要有白屈菜碱、小檗碱、白屈菜红碱等。研究表明，血根碱对于菜青虫、叶螨、指环虫等具有较强的毒性[3-4]。对某些真菌、细菌和病毒有抑制作用，但对神经、心脏等有毒害，可引起麻痹、心脏抑制，甚至导致死亡。近年来随着人们不断地从白屈菜中分离出白屈菜碱、白屈菜红碱和血根碱等有效活性成分，白屈菜在各个领域的研究也越来越广泛[5-7]。但是对其杀虫方面的研究却少有报导。本研究通过对白屈菜的粗提和纯化，以舞毒蛾3龄幼虫为测试对象，研究了白屈菜总碱对舞毒蛾离体酶活性的影响，探讨了白屈菜总碱对舞毒蛾的毒杀作用机理，为其在林业害虫防治中的应用奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

白屈菜采于东北林业大学实验林场，取40 g过60目筛的白屈菜干粉与400 mL 80%乙醇溶液混合。在60 ℃、90 Hz条件下超声处理50 min。抽滤后弃去滤出的粉末，15000 r/min下冷冻离心10 min，将上清液置于旋转蒸发仪上，将溶液中的有机溶剂全部蒸发，余下油状物质即为白屈菜碱粗提物，避光低温保存4℃冰箱中。

舞毒蛾(Lymantriadispar)虫卵采于东北林业大学校园内，消毒后放于25 ℃条件下用人工饲料进行饲养。待培养到3龄幼虫后，取出相同大小的健康幼虫放于-80 ℃冰箱备用。

1.2 白屈菜碱粗提物的纯化

将 AB-8大孔树脂进行预处理，湿法装住后静置40 min。以3 mL/min的吸附流速上样，直到样品被完全吸附，静置6 h。最后用95%乙醇溶液洗脱，在有黄色液体流出时开始接收至流出液无色，收集全部洗脱液，减压回收溶剂，低温烘干得到白屈菜总碱。

将纯化出的白屈菜总碱配制成浓度为0.1、1、10、100 、1000 mg/mL的溶液，用于离体酶活的测定。

1.3 离体酶液制备及酶活性的测定

取舞毒蛾3龄幼虫4头，用pH 7.5 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(PBS)清洗体表，去除肠道内含物，置于玻璃匀浆器中，按舞毒蛾幼虫体重加入不同pH 值的预冷 PBS(1mL/g，于 4 ℃，12000 r/min 离心15 min，上清液即为酶源，并将酶源用0.1mol/L 磷酸缓冲液配制成不同的浓度。在 GST 和 CAT的制备中，分别用含 1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)的 1.0 mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH6.5)(缓冲液用前加 PMSF 和 DTT 至终浓度为1.0mmol/L)及 pH 7.0 0.1mol/L 磷酸缓冲液代替 pH 7.5 0.1mol/L 磷酸缓冲液。

1.3.1 AChE活性测定。AChE活性测定参考Gorun改进的Ellman方法[8]。对照组和处理组同时取0.2 mL不同浓度的待测酶液，对照组加入40%乙醇，处理组加入1 mL不同浓度的白屈菜总碱，反应3 min后与0.6 mL ATCI混匀，35 ℃水浴加热15 min，再加入2.0 mL显色剂(DTNB)终止反应，于412 nm波长下测定光密度值(OD412)。

1.3.2 CarE活性测定。CarE活性测定参照Van Asperen等的方法[9]，略加改进。对照组和处理组分别将0.05 mL稀释酶液与1 mL 40%乙醇和1 mL不同浓度的白屈菜总碱混匀，3 min后加入2 mL 3×10-4mol/L α-乙酸萘酯底物溶液(含毒扁豆碱1∶1)，混匀后，35 ℃水浴保温10 min后，加入0.90 mL显色液(5%十二烷基硫酸钠∶1%固蓝B盐=5∶2)终止反应，于600 nm波长下测光密度值OD600。

1.3.3 GST活性测定。GST活性测定参照Habig(1974)和Oppenoort等(1979)方法[10-11]。总反应体系为3.1 mL，含有1.0 mL 0.1 mol/L PBS、1.0 mL 5 mmol/L GSH和1.0 mL稀释酶液，对照组和处理组分别加入1 mL 40%乙醇和1 mL不同浓度的白屈菜总碱，35 ℃水浴孵育10 min，加入0.1 mL 1.0 mmol/L DCNB底物，于345 nm波长下每隔30 S测定光密度值OD345，记录3 min内OD345变化值△OD345。

1.3.4 SOD活性测定。SOD比活力参照(Beauchamp和Fridovich,1971；Maleck A 等,2001)的NBT法进行[12]。反应体系中含有80 μmol/L的核黄素、77 μmol/L的NBT、13 mmol/L的MET、0.1 mmol/L的EDTA和50 μL酶液，对照组加入1 mL40%乙醇，处理组加入1 mL不同浓度的白屈菜总碱。于4000 lx下光照5 min后，遮光停止反应，测定OD560，并测定酶液的蛋白质含量。

1.3.5 CAT活性测定。CAT活性测定参照张友军等方法[13]。反应体系含有0.1 mol/L pH7.0的PBS、0.08%H2O2和0.05 mL酶液对照组加入1 mL40%乙醇，处理组加入1 mL不同浓度的白屈菜总碱。测定OD240，每30s记数一次，共记录3 min，测定每分钟OD240的变化值，同时测定酶液的蛋白质含量。

2 结果分析

2.1 白屈菜粗提物的纯化

利用大孔树脂AB-8吸附法从白屈菜粗提物中分离得到白屈菜碱、盐酸小檗碱、血根碱、四氢黄连碱和黄连碱等5种主要生物碱，并通过HPLC-MS对5种生物碱进行了鉴定及定量分析，结果见图1。按照每种生物碱含量由高到低依次为：黄连碱>白屈菜碱>盐酸小檗碱>血根碱>四氢黄连碱。

图1 白屈菜总碱高效液相图谱

2.2 白屈菜总碱对舞毒蛾离体酶活影响

2.2.1 白屈菜总碱对AChE的作用。白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体AChE活性抑制作用呈现明显的剂量-效应关系，结果见图2。

图2 白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体AChE活性的影响

由图2可知，白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体AChE活性有抑制作用，AChE抑制率随着白屈菜总碱处理浓度的升高而升高，存在显著的剂量-效应关系。在浓度为1000 mg/mL时，白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫的抑制率为88%。但在低浓度时，白屈菜总碱对AChE的抑制率仅为9%。

2.2.2 白屈菜总碱对CarE的作用。白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体CarE活性影响见图3。

图3 白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体CarE活性的影响

由图3可知，白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体CarE活性抑制作用呈现明显的剂量-效应关系。总体上CarE活性随着白屈菜总碱处理浓度的升高而降低。在白屈菜总碱浓度为1000 mg/mL时，白屈菜总碱对舞毒蛾幼虫CarE的抑制率为43%，浓度为100 mg/mL时抑制率为44%，浓度为1 mg/mL时，抑制率仅为15%。

2.2.3 白屈菜总碱对GST的作用。白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体GST活性抑制作用呈现明显的剂量-效应关系，结果见图4。

图4 白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体GST活性的影响

由图4可知，白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体GST活性有抑制作用，GST抑制率随着白屈菜总碱浓度的升高而升高。在白屈菜总碱浓度为1000 mg/mL时，白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫GST的抑制率为80%，浓度为100 mg/mL，抑制率为65%，浓度为0.1 mg/mL时，抑制率为22%。

2.2.4 白屈菜总碱对SOD的作用。白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体SOD活性有抑制作用，结果见图5。

图5 白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体SOD活性的影响

由图5可知，对SOD的抑制率随着白屈菜总碱浓度的升高而升高，且存在显著的剂量-效应关系。在浓度为1000 mg/mL时，白屈菜总碱对舞毒蛾幼虫SOD的抑制率达到了85%，在100 mg/mL时，对SOD的抑制率为52%，在10 mg/mL和0.1 mg/mL时，抑制率分别为19%和6%。

2.2.5 白屈菜总碱对CAT的作用。白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体CAT活性有抑制作用，对CAT的抑制率随着白屈菜总碱处理浓度的升高而升高，且存在显著的剂量-效应关系，结果见图6。

图6 白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫离体CAT活性的影响

由图6可知，在浓度为1000 mg/mL时，白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫CAT的抑制率在59%，在浓度为100 mg/mL时，对CAT的抑制率为51%，当浓度为1 mg/mL时，对CAT抑制率为37%，在0.1 mg/mL时，白屈菜总碱对CAT抑制率为18%。

2.2.6 白屈菜总碱对舞毒蛾体内酶活IC50的测定。根据相应的剂-效关系，用二次方程分别计算出白屈菜总碱对5种酶的抑制中浓度(IC50)，结果见表1。

由表1可知，白屈菜总碱对GST的IC50为5.333 mg/mL，显示出最强的抑制活性，对AChE的IC50为7.122 mg/mL，也具有显著的抑制作用。此外，白屈菜总碱对两种保护酶SOD和CAT的IC50值分别为1.24×102mg/mL和5.126×101mg/mL，有较为明显的抑制作用。白屈菜总碱对CarE(IC50=3.475×103mg/mL)的抑制作用最弱。因此，根据离体IC50值，得出白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫5种离体酶的敏感性依次为GST>AChE>CAT>SOD>CarE。

表1 白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫体内酶活IC50值

3 结论与讨论

本试验用AB-8大孔树脂对白屈菜粗提物进行纯化，经高效液相分析，得到5种生物单碱，其含量从高到低依次是黄连碱>白屈菜碱>盐酸小檗碱>血跟碱>四氢黄连碱。牛长群用高效薄层色谱法对白屈菜中的生物碱进行了种类、含量测定[14]，得到8种单碱，除了白屈菜红碱外，多分离出的另两种单碱的含量相对较少，所占比例均未达到总碱的0.05%。其它单碱含量与本试验得出的结果基本相符，黄连碱和白屈菜碱含量较高，其次为白屈菜红碱和盐酸小檗碱，四氢黄连碱含量相对较少，与本研究结果基本吻合。

研究得出白屈菜总碱对舞毒蛾3龄幼虫5种离体酶活均有显著的抑制作用。尤其对谷胱甘肽S-转移酶(GST)具有最强的抑制活性，而对羧酸酯酶(CarE)抑制活性最弱，其敏感性依次为GST>AChE>CAT>SOD>CarE。

当白屈菜总碱对昆虫体内酶活系统造成干扰时，谷胱甘肽S-转移酶作为昆虫体内一种重要的解毒酶活性就会受到影响，遭到破坏[15]；而乙酰胆碱酯酶在维持神经冲动传导中起着重要作用，它主要通过催化水解乙酰胆碱来保证神经冲动的正常传递，是多种植物源杀虫剂的主要靶标酶之一[16,18]，本研究也证实了乙酰胆碱酯酶对白屈菜总碱有着较强的敏感性；昆虫体内的保护酶可以保护昆虫有机体免受外界刺激侵害[19,21]。超氧化物歧化酶是昆虫体内最重要的清除自由基的酶，它清除O2-生成H2O2后，H2O2与O2-形成毒性更强的HO，必须由过氧化氢酶来分解H2O2[22]。在本实验中，当低浓度白屈菜总碱侵入昆虫体内时，其对两种保护酶的抑制作用并不明显，甚至起到了一定的激活作用，但随着药剂累加，药害加强，两种保护酶的活性就会得到显著抑制。

[1]周治德,李晓刚,李桂银.植物源农药的现状及发展趋势[J].广东化工,2013(19):68-69.

[2]王以燕,袁善奎,李友顺.美国EPA登记的生物农药有效成分名录2009,30(8).

[3]刘计权,韩晓静,谢树莲.植物源农药防治根结线虫研究进展[J].农药,2011(6):395-398

[4]赵善欢.中国植物质杀虫剂的研究(英语)[J].Entomologia Sinica,1994(4): 365-374.

[5]丁吉同,唐桦,阿地力·沙塔尔,等.4种植物源杀虫剂对亚洲型舞毒蛾幼虫的毒性与拒食作用[J].南京林业大学学报(自然科学版),2013,48(4):80-84.

[6]颜成生,彭曙光,单雪华,等.鱼藤酮对烟草斜纹夜蛾和烟青虫的防治效果[J].作物研究,2015(6):647-650.

[7]王新华,刘敏艳,胡冠芳,等.顶羽菊提取物对鳞翅目幼虫的杀虫活性研究[J].西南农业学报,2015,12(3):1124-1129.

[8]蒋小龙,杨嘉谷,刘文斌,等.花椒对玉米象、储粮曲霉和青霉防效的初步研究[J].郑州粮食学院学报,1992(3):30-39.

[9]Van Asperen K. A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method[J]. Journal of insect physiology, 1962,8(4):401-416.

[10]Oppenoorth F J, Van der Pas L J T, Houx N W H. Glutathione S-transferase and hydrolytic activity in a tetrachlorvinphos-resistant strain of housefly and their influence on resistance[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,1979,11 (1):176-188.

[11]Habig W H, Pabst M J, Jakoby W B. Glutathione S-transferases the first enzymatic step in mercapturic acid formation[J].Journal of biological Chemistry,1974,249(22):7130-7139.

[12]Beauchamp C,Fridovich I.Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels[J].Analytical biochemistry,1971,44(1):276-287.

[14]牛长群,何丽一. 白屈菜中异喹啉生物碱的高效薄层分离及荧光扫描法[J].药学学报,1992(1):69-73.

[15]张友军,王光锋,吴青君,等.多杀菌素对不同发育阶段甜菜夜蛾的毒力及其体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的影响[J].农药学学报,2003,5(3):31-38.

[16]蒋继宏,吴薇,陈凤美,等.苦豆碱对小菜蛾体内保护酶系统活力的影响[J].江苏农业科学,2004(5):56-57.

[17]黄菁,乔传令.昆虫解毒酶解毒机理及其在农药污染治理中的应用[J].农业环境保护,2002(3):285-287.

[18]邹宇晓,昆虫应激代谢产物-热休克蛋白及保护酶研究概况[J].广东蚕业,2000,34(1):55-58.

[19]刘丽华,王双,关磊.北乌头乙醇提取液对菜青虫体内保护酶活性的影响[J].江苏农业科学,2015(1):146-147.

[20]赵云峰,杨峰,郑莹光,等.活性氧自由基对固氮酶铝铁蛋白的损伤[J].吉林大学自然科学学报,1994,11(4):79-81.

[21]廖月枝,严善春,曹传旺,等.甲氧虫酰肼对舞毒蛾幼虫解毒酶及其体内蛋白质表达的影响[J].林业科学,2012,23(8):99-105.

[22]鄢杰明,钟华,严俊鑫,等.多杀菌素对舞毒蛾幼虫解毒酶活性的影响[J].林业科学,2012,43(9):82-87.

EffectsofTotalAlkaloidsfromtheChelidoniummajusontheEnzymesActivitiesinLymantriadisparinVitro

Lv Chunhe,Zhang Guocai*,Zou Chuanshan
(Northeast Forestry University, Harbin 150040)

Purify the crude extract ofChelidoniummajus to get the total alkaloids ofChelidonium,determine the five in vitro enzyme activities of 3rd instar larvae.The results show:five main isoquinoline alkaloids in C. majus are successfully isolated using macroporous resin AB-8 adsorption,content from high to low followed by coptisine>celeryridine > berberine hydrochloride > sanguinarine > tetrahydrocoptisine. the strongest inhibitory activity to glutathione S-transferase (GST) IC50:5.333mg/mL, and the weakest inhibition to carboxylesterase (CarE). IC50:3.475×103mg/mL.The IC50 values of five enzymes is in a decreasing order of GST>AChE>CAT>SOD>CarE.

Chelidoniummajus;Lymantriadispar; Alkaloid;Enzymatic activity

2017-04-27

吕春鹤(1991-)，女，硕士，研究方向：生物化学防治，E-mail：1547481870@qq.com；*通讯作者：张国财(1964-)，男，教授，研究方向：生物化学防治，E-mail：zhang640308@126.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.04.009

S767.3+7

:A