MR molecular imaging of pancreatic cancer cell targeted by superparamagnetic iron oxide nanoparticles

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(Department of Hepatobiliary Surgery, Fudan UniversityPudong Medical Center, Shanghai 201399， China)

MR molecular imaging of pancreatic cancer cell targeted by superparamagnetic iron oxide nanoparticles

ZHANGChongjie，ZOUQi，CHENJie，LIChunsheng*

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,FudanUniversityPudongMedicalCenter,Shanghai201399，China)

Objective To explore the feasibility of MR molecular imaging in human pancreatic cancer cell (BxPC-3 cell) targeted by superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Methods Both MUC1-SPION probes with MUC1 targeted modification (targeted group) and bull serum albumin (BSA)-SPION as the control (non-targeted group) were prepared. The cytotoxicity of MUC1-SPION in different concentrations (0, 6.25, 12.50, 25, 50, 100, 200 μg/ml) was verified by MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. BxPC-3 cells were cultured with MUC1-SPION (targeting group) and BSA-SPION (control group) in different concentration as 50, 100, 200 μg/ml, respectively for 2 h. Then MRI scans were performed, the transverse relaxation time (T2) value and the enhancement ratio of T2 were recorded and calculated. The combination conditions of targeting probes and cells were observed by prussian blue staining. Results The cell cytotoxicity of MUC1-SPION in different concentrations showed no statistical difference according to MTT assay (F=1.74,P=0.18). There were statistical differences of the T2 value and the enhancement ratio of T2 for the concentration as 50, 100, 200 μg/ml, respectively (allP<0.05). More blue particles were observed by prussian blue staining in targeted group than in non-targeted group. Conclusion MUC1-SPION has favourable targeting ability to BxPC-3 cell, and MRI of BxPC-3 cell targeted by SPION is satisfied security and feasibility.

Magnetic resonance imaging； Superparamagnetic iron oxide nanoparticles； Pancreatic neoplasms

胰腺癌是临床常见的恶性肿瘤，因其恶性程度高、早期症状隐匿，早期诊断及鉴别诊断困难，约80%的患者确诊时已错过手术治疗的最佳时机[1]。对胰腺癌进行早期诊断并及时行根治性手术是目前有效提高生存期的唯一方法。目前对胰腺癌发病机制的研究已深入至分子水平。研究[2]显示，多种信号通路异常活化与胰腺癌发生密切相关。MRI具有空间分辨率高、组织对比度好等优点，在胰腺癌的诊断中有重要作用。超顺磁性纳米氧化铁颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles， SPION)作为新型的MRI对比剂，能明显增强MR信号强度，使得信号对比度更大，成像敏感度更高。同时SPION具有超顺磁性、良好的生物相容性、较强的可塑性、毒副反应小、比表面积大和稳定性高等优点，适用于分子探针的制备。理论上，SPION可与特异性配体(如抗体、多肽、多糖、核苷酸、核酸适体和其他合成模拟物)相结合，制备针对各种肿瘤的靶向探针，从而实现对肿瘤组织的MR成像[3]。黏蛋白1(mucoprotein-1， MUC1)是由MUCl基因编码的一种高分子量蛋白，仅在少数几种癌细胞表面(如胰腺癌、乳腺癌及卵巢癌等)呈异常高表达，在胰腺癌中阳性表达率高达83%以上，而在正常上皮细胞表达水平较低，且MUC1可能参与了从细胞癌变至侵袭和转移的整个过程[4]。本研究以MUC1为分子探针靶点，从体外细胞水平探讨该靶向探针对胰腺癌细胞行MR分子靶向成像的可行性。

1 材料与方法

1.1 MUC1-SPION靶向分子探针的构建与分组 首先进行MUC1与SPION颗粒的化学共轭拼接，将50 μl MUC1单克隆抗体(monoclonal antibody of mucoprotein-1， Anti-MUC1；Abcam公司)加入0.5 ml浓度为1 mg/ml的SPION溶液(由上海交通大学-纳米生物医学研究中心提供)中，充分混匀15 min，再加入2 mg碳二亚胺[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，Sigma公司]，室温振荡过夜。用相同方法将牛血清蛋白(bull serum albumin， BSA；Gibco公司)与SPION进行拼接，分别制备出MUC1-SPION靶向分子探针和BSA-SPION非靶向分子探针。利用MUC1-SPION进行实验为靶向组，利用BSA-SPION进行实验为非靶向组。

1.2 噻唑蓝[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide， MTT]法细胞毒性实验 取对数生长期的胰腺癌细胞株BxPC-3(上海生命科学研究院)，接种于96孔板内，将细胞浓度设置为5000个/孔，每孔加入完全培养基(Gibco公司)200 μl。在CO2浓度为50 ml/L、饱和湿度、37℃培养箱中预培养24 h后加入不同浓度的MUC1-SPION溶液15 μl，MUC1-SPION的铁浓度分别为0、6.25、12.50、25、50、100、200 μg/ml。每一浓度设4个复孔，并设1个对照孔(仅为BXPC-3细胞)，继续培养24 h。而后每孔加入20 μl的MTT溶液，孵育90 min，所有涉及MTT的实验均避光。

采用TECAN多功能酶标检测仪，选择490 nm波长测定各孔的吸光度(absorbancy， A)值。计算细胞增殖率，细胞增殖率=实验孔平均A值/对照孔平均A值×100%。绘制柱形图，观察细胞的增殖情况。

1.3 细胞株水平MR分子靶向成像 将对数生长期的BxPC-3细胞接种于24孔板中，每孔细胞接种量为6×104个，加入1 ml完全培养基，待细胞贴壁后，弃去培养基，在非靶向组中加入BSA-USPION溶液200 μl，铁浓度分别为50、100、200 μg/ml，另取相同浓度的MUC1-USPION溶液200 μl加入靶向组中，在培养箱中孵育2 h后，用PBS彻底清洗沉积的铁粒子，将贴壁的细胞转移至EP管中，制成细胞悬液，以备MRI分析。

MRI扫描采用纽迈NMI20型MR扫描仪，行T2WI扫描，扫描参数：TR 5 000 ms，TE 0.8 ms，重复采样等待时间15 000 ms，回波个数18 000，扫描次数4，90°脉宽(P1)为18 μs，180°脉宽(P2)为35 μs。记录各组的T2值，并计算T2强化率，T2强化率=(MO-MS)/MO×100%，其中MO为单纯细胞的T2值，MS为对比剂与细胞孵育后的T2值。

1.4 组织学观察 将对数生长期的BxPC-3细胞接种于24孔板中，每孔细胞接种量为6×104个，加入1 ml完全培养基，待细胞贴壁后，以4%多聚甲醛溶液固定30 min，与MUC1-SPION、BSA-SPION溶液分别孵育2 h，以PBS反复冲洗3次，去除沉积的铁粒子后行普鲁士蓝染色，用2%亚铁氰化钾和2%盐酸水溶液混合液(1∶1)染色15～30 min，蒸馏水清洗，再以1%核固红复染10 min。采用倒置荧光显微镜(德国莱卡DM2500)，分别对靶向组及非靶向组细胞进行镜下观察。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。以单因素方差分析比较不同MUC1-SPION浓度下BXPC-3细胞增殖率的差异，以独立样本t检验比较靶向组与非靶向组间T2值及T2强化率的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞毒性MTT法 细胞毒性实验显示不同MUC1-SPION浓度下BxPC-3细胞增殖率差异无统计学意义(F=1.74，P=0.183)，见图1。

图1 不同MUC1-SPION浓度下胰腺癌细胞株BxPC-3的增殖率

2.2MR分子靶向成像 分别以不同浓度的BSA-SPION及MUC1-SPION标记BxPC-3细胞，并共同孵育2 h后，MRI显示靶向组与非靶向组细胞的T2信号均下降，下降程度随着纳米颗粒浓度的增加而增大(图2)。铁浓度分别为50、100、200 μg/ml时，2组间T2值和T2强化率的差异均有统计学意义(P均<0.05，表1、2)。

图2 铁浓度分别为50、100、200 μg/ml时靶向组(A)与非靶向组(B)MR图像

组别50μg/ml100μg/ml200μg/ml靶向组62．93±2．8540．37±3．0645．04±1．94非靶向组83．65±1．4363．21±2．3119．81±2．20t值-14．68-12．0860．32P值<0．01<0．01<0．01

表2 靶向组与非靶向组不同铁浓度下与BxPC-3细胞共同孵育2 h后的T2强化率比较(%，±s)

表2 靶向组与非靶向组不同铁浓度下与BxPC-3细胞共同孵育2 h后的T2强化率比较(%，±s)

组别50μg/ml100μg/ml200μg/ml靶向组48．15±3．5066．46±2．8083．14±0．80非靶向组30．50±1．9047．19±0．3062．14±1．50t值9．9815．1627．53P值<0．01<0．01<0．01

2.3 组织学结果 光镜下普鲁士蓝染色图见图3。靶向组中细胞膜周围可见大量蓝染铁颗粒，胞浆中也有少许铁颗粒存在。非靶向组中蓝染颗粒较少，且主要分布于细胞外间隙中。

3 讨论

目前，钆对比剂为临床常用的MRI多期增强扫描对比剂，对部分典型的胰腺癌病灶可早期诊断，但对于影像学表现不典型的胰腺癌，则难以与其他胰腺病变(如肿块型慢性胰腺炎、无功能内分泌肿瘤)相鉴别[5]。SPION为MR T2WI对比剂，当其不均匀分布于靶组织后，造成局部磁场的不均匀，从而加速质子去相位过程，缩短T2值，使靶组织信号降低(阴性增强)[6]。当粒子大小达到纳米级时，可形成单磁域，从而具有超顺磁性[7]。同时，SPION可通过灵活的表面修饰，与特异性受体、抗体及转染剂结合，构建成具有靶向性的生物探针。近年来，已有学者选用尿激酶纤溶酶原激活物受体[8]，表皮生长因子受体[9]，趋化生长因子受体4[10]作为靶点，成功制备各种类型的SPION靶向探针，并将其应用于肿瘤细胞的MRI研究。

MUC1在肿瘤组织中多呈现异常表达，表达量可达正常细胞的10倍以上，且高表达的程度与细胞恶性程度成正相关[11]。在胰腺癌细胞中MUC1的分布极性消失，整个腺上皮细胞表面均表达MUC1，胞浆中也存在少量表达，因此MUC1成为胰腺癌细胞理想的作用靶点[12]。SPION粒径较小，具有较长的半衰期，在经过长时间的血循环到达肿瘤部位后，通过高通透效应和高滞留(enhanced permeability and retention， EPR)效应进入肿瘤组织，再由单克隆抗体MUC1介导，与肿瘤细胞表面的特异性受体结合，达到对胰腺肿瘤的MR增强效果[13]。该作用方式为主动靶向机制，其主要通过SPION表面共价键耦联可反映功能基团特异性识别并结合肿瘤细胞膜表面的蛋白，而进行定向成像，在肿瘤早期诊断与鉴别诊断方面具有技术优势[14]。

图3 BxPC-3细胞与MUC1-SPION、BSA-SPION分别孵育2 h后普鲁士蓝染色图(×200) A.靶向组； B.非靶向组

本实验中制备的MUC1-SPION经MTT法细胞毒性实验后，发现该探针对于BxPC-3细胞的细胞活性无明显影响，在铁浓度为200 μg/ml以内时，细胞增殖率均保持在80%以上，在细胞水平行MR分子成像时，探针最高铁浓度为200 μg/ml，处于已验证的安全范围内。当细胞暴露于高剂量的氧化铁纳米粒子时，可生成过量活性氧自由基，影响细胞的正常功能，最终导致细胞死亡[15]。

传统的影像学检查技术对于肿瘤的诊断往往依赖于解剖学形态的改变，此时肿瘤细胞的数量至少已达到1×109个，而当肿瘤细胞数量为1×106时，往往已具备转移的能力[16]。因此，多数既往临床发现的“早期肿瘤”实际上已存在数月甚至数年的时间，并早已具有淋巴结或远处转移风险。本研究进行细胞水平的MR分子成像，发现与肿瘤细胞共孵育后，靶向组的T2强化率明显高于非靶向组(P均<0.05)，表明MUC1介导的靶向探针具有更好的成像效果。本研究中，普鲁士蓝染色实验更直观地显示癌细胞膜上能结合更多的蓝染铁颗粒，表明T2值的降低主要与胰腺癌细胞的特异性结合相关。由此可见，MUC1-SPION作为MRI靶向对比剂在影像学诊断早期胰腺癌中具有独特优势。

本研究的不足在于，实验的研究范围依然停留于细胞领域，尚缺乏在体动物实验及临床实验的数据加以验证。

综上所述，MUC1介导的SPION可与胰腺癌细胞特异性结合，实现MRI分子靶向成像，且具有良好的生物安全性和可行性。

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上海市浦东新区科技发展基金医疗卫生项目(PKJ2015-Y33)。

张重捷(1990—)，男，浙江宁波人，在读硕士，医师。研究方向：肝胆外科。E-mail: 657391674@qq.com

李春生，复旦大学附属浦东医院肝胆外科，201399。E-mail: chunshenglish@126.com

2016-11-21

2017-05-11

超顺磁性纳米氧化铁颗粒标记胰腺癌细胞的MR分子成像

张重捷，邹 奇，陈 杰，李春生*

(复旦大学附属浦东医院肝胆外科，上海 201399)

目的 探讨超顺磁性纳米氧化铁颗粒(SPION)靶向标记胰腺癌细胞(BxPC-3)行MR分子成像的可行性。方法 制备黏蛋白1(MUC1)靶向修饰的探针MUC1-SPION(靶向组)，并以牛血清蛋白(BSA)制备非靶向探针BSA-SPION(非靶向组)。采过噻唑蓝(MTT)法测试不同MUC1-SPION浓度下(铁浓度为0、6.25、12.50、25、50、100、200 μg/ml)的细胞毒性。并分别于铁浓度为50、100、200 μg/ml条件下，对靶向组及对照组与BxPC-3细胞共同孵育2 h后的细胞悬液进行MR成像，测定横向弛豫时间(T2)，计算T2强化率。以普鲁士蓝染色观察靶向探针与细胞结合情况。结果 MTT法细胞毒性实验显示，不同MUC1-SPION浓度下BXPC-3细胞增殖率差异无统计学意义(F=1.74，P=0.183)。铁浓度50、100、200 μg/ml条件下，2组间T2值和T2强化率的差异均有统计学意义(P均<0.05)。普鲁士蓝染色显示靶向组的蓝染颗粒更多。结论 MUC1-SPION对BxPC-3细胞具有良好的靶向性，以SPION靶向标记BxPC-3细胞进行MRI安全、可行。

磁共振成像；超顺磁性纳米氧化铁颗粒；胰腺肿瘤

R-332； R445.2

A

1003-3289(2017)08-1158-05

10.13929/j.1003-3289.201611107