针刺“百会”透“曲鬓”对急性脑出血大鼠血清中P选择素(CD62p)的表达影响的实验研究

关瑞桥，邹伟，于学平，孙晓伟，戴晓红，滕伟，张鑫，袁梦飞

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

针刺“百会”透“曲鬓”对急性脑出血大鼠血清中P选择素(CD62p)的表达影响的实验研究

关瑞桥1，邹伟2*，于学平2，孙晓伟2，戴晓红2，滕伟2，张鑫2，袁梦飞1

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的:通过观察 “百会” 透 “曲鬓”头针针刺法对急性脑出血大鼠脑组织中CD62p表达的影响，来揭示针刺头部腧穴对脑出血后炎症反应影响的相关机理方法：选取132只雄性Wistar大鼠随机分3组：空白对照组12只大鼠，脑出血模型组，针刺治疗组各60只大鼠。后两组又随机分为6 h，24 h，3 d，7 d四个亚组，每组大鼠数量均等。针刺组分别于相应的时间点进行针刺治疗，空白组，脑出血作为对照组不做处理。在完成治疗后，于相应的时间点对大鼠进行神经功能评分，然后处死大鼠提取血清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆CD62p表达水平。结果：经针刺治疗后，针刺组大鼠的神经功能缺损体征较同时间点的脑出血对照组明显减轻，差异具有统计学意义(P<0.01)。CD62p酶联免疫吸附法检测结果显示，脑出血组，针刺组CD62p水平较空白组明显增高，并有显著差异(P<0.01)；针刺组脑组织中CD62p水平较相应时间段的脑出血组低，并有显著差异(P<0.01)；脑出血组，针刺组在3d时脑组织中CD62p含量较其他时间段高，并有显著差异(P<0.01)。结论：“百会透曲鬓” 针刺法可明显改善大鼠的神经功能学评分，有利于脑出血后肢体运动功能的恢复；“百会”透“曲鬓”针刺疗法，可能通过抑制CD62p在血小板膜上的表达，从而在一定程度上抑制脑出血后炎症反应，及脑水肿的形成。

“百会”透“曲鬓”针刺疗法；急性脑出血；炎症反应；CD62p

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外伤性脑实质出血，占所有中脑出血卒中的10%～17%，急性脑出血的死亡率和致残率极高。近年来研究表明[1-3]，脑出血后神经功能进一步恶化的原因主要由于血肿周围脑组织继发性脑水肿和脑损伤所致。炎症反应是造成继发性脑损伤的重要原因，其中血小板的活化，是炎症反应的关键过程之一。本次课题以脑出血后的炎症反应为着手点，选择CD62p作为检测指标。

CD62p属于选择素家族，是一种相对分子量为140KD的跨膜糖蛋白，存在于活化的血小板膜上，定位于血小板α-颗粒和内皮细胞Weible-palade小体内[4]。血小板活化时CD62p分子在血小板膜上表达，介导血小板与粒细胞及内皮细胞的粘附与连接CD62p在其他粘附分子的协助下，使白细胞穿过血管壁进入脑实质，导致缺血区脑组织的损伤水肿。

实验通过针刺“百会”透“曲鬓”穴，观察在针刺治疗过程中，CD62p在脑出血大鼠血清中的动态变化，从而探究CD69p与脑出血后炎症反应，血栓等形成的关系，进一步了解脑出血严重程度及预后。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

清洁级Wistar雄性健康大鼠，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(合格证书号：SCXK (黑)20150023 )，体质量(300±20)g，室温条件下饲养，自由摄食，给予清洁饮用水，实验前正常饲养1周，造模前禁食12 h，禁水6 h。

1.1.2 主要仪器

立体定位仪(STW-1型，中国成都仪器厂)；微量注射器(YY0088-92型，宁波市镇江三爱仪器厂);台式牙钻机(307-6型，中国上海齿科医械厂)；酶标仪(美国Bio-TEK公司synergyHT型)；大鼠P选择素酶联分析法试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立

脑出血模型的制备模型制备方法依照邹氏法和Rosenberg法[5]，并依需要改良。首先腹腔注射水合氯醛麻醉(10%，300 mg/kg)，将大鼠常规备皮后俯卧固定在立体定位仪上并固定。用碘伏在手术处进行消毒后，在头部正中做纵型切口，暴露骨膜及前囟点，用无菌镊子剥离骨膜后，以前囟为中心，在前囟点右侧3.5 mm，后0.2 mm处做标记，再用牙钻在标记点处钻出直径为0.1 mm的圆孔，深度需达硬膜表面。注血采用自体尾尖取血，在尾尖用剪刀剪断，用微量注射器吸取50 μL血液。将微量注射器固定于立体定位仪上，将针头插入前囟孔约6 mm，将50 μL尾尖血缓慢注射进尾壳核，速度约为20 μL/min，全部注入后留针约5 min，然后缓慢出针。在留针同时消毒大鼠尾部伤口后包扎。术后用牙科磷酸锌水门汀封闭颅骨钻孔，并在伤口处用庆大霉素消毒以防感染。最后缝合大鼠头部皮肤，用碘伏消毒防止感染。空白对照组大鼠不做任何处置，并按标准饲养。

1.2.2 行为学观察

待大鼠在手术后完全清醒，在相应时间点，即6 h,24 h,3 d,7 d进行神经功能缺损评价，采用Berderson[6]评分方法对大鼠神经功能进行评分。具体标准如下 ：①轻抓大鼠尾巴提起高于桌面10 cm，正常大鼠前爪伸直，无神经功能缺损;② 无任何神经功能缺损，0分 ； ③大鼠脑出血病变对侧腕关节，肘关节屈曲，肩部内收，1分； ④上述体征伴有向麻痹侧推阻力下降，2分； ⑤行走时时向麻搏侧打圈，表现出追尾状，3分。

1.2.3 实验动物的干预方法

经神经体征评分筛选出132只雄性Wistar大鼠，随机分3组：空白对照组12只，脑出血模型组，针刺治疗组各60只。后两组又随机分为6 h，24 h，3 d，7 d四个亚组(每组大鼠数量均等)。其中脑出血模型组和针刺治疗组按上述方法制备脑出血模型，空白组不做任何处理，并按标准饲养。

脑出血模型组：实验过程中以和针刺组同样的方式捆绑大鼠，每次30 min，每天1次。

针刺治疗组：在大鼠手术清醒后针刺治疗，6 h组1次，24 h组1次，3 d、7 d组每日1次。用华佗牌28号1寸毫针，向右百会透刺曲鬓穴，取血标准参照《实验动物学图谱》[7]，进针约0.8寸，留针30 min，期间捻针3次，每次2 min,速度不少于200 r/min。空白组：不做任何处理，并按标准饲养。

1.2.4 血清中选择素CD62p的测定

本次实验采用腹主动脉采血法，腹腔注射水合氯醛麻醉(10%，300 mg/kg)后。将大鼠仰卧固定在手术台上。消毒后沿腹正中线剪开腹腔。将肠管及组织移向左侧腹部，暴露右侧颜色稍白的腹主动脉。手术者右手持 5mL空针，针尖斜面朝下，以25°～30°刺入腹主动脉，深度约5 mm左右，抽吸血液，每只大鼠采血约5 mL。 取血后静置20 min， 用离心机以3 000/min的速度离心20 min，分离后取上清液，-20 ℃冰箱冷冻备用。采用酶联免疫吸附法(Elisa)进行CD62p测定,操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 结果分析

2 实验结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损体征评分

各组大鼠于相应的时间点，在取材前进行神经功能评分，观察并记录。由表1可见，空白组因不做任何处理，没有神经功能缺损的表现，为0分。而经过脑出血造模手术并合格的大鼠，在术后不同的时间点表现出不同的神经功能损伤体征，包括爬行时向右侧(健侧)倾斜、划圈，另一侧(左侧)瘫痪的前肢屈曲而内收，瘫痪侧(左侧)后肢向后外伸展。在手术后第3天时，神经功能损伤症状最为严重，如追尾动作，各项瘫痪体征加重等；在第7天时各组已经有明显好转。

表1 Berderson大鼠神经功能缺损评分比较

注：与空白组比较，☆P<0.05；与模型组比较，★P<0.05

其中经过针刺治疗的大鼠，在各个时间段神经功能损伤的体征较模型组不同程度减轻。在6 h时，评分显示差异不明显，往后自24 h，3 d，7 d，评分与模型组比较差异明显，具有统计学意义(P<0.05)(见图1)。

图1 各时间段每组Berderson评分比较

2.2 各组大鼠血清中CD62p的含量

2.2.1 不同组间及不同时间点CD62p浓度比较

对数据整理分析后进行重复测量设计方差分析。单独分析组别和时间变量时，不同组间CD62p浓度不同,差异具有统计学意义(F=5.31,P<0.01)；不同时间之间CD62p浓度差异具有统计学意义(F=63.43,P<0.01) (见表2)。组别、时间及交互作用均进入模型后参数估计结果显示仍具有统计学意义，即时间与组别存在交互作用，说明各组间不同时间点CD62p浓度变化趋势有差异，通过趋势性分析可知不同组随着时间的推移, 模型组与针刺组均表现为先升后降，均在第3天是达到浓度高峰(见图3)。

图2 各时间段各组CD62p浓度比较

图3 时间与组别间交互作用图

组别(编号)n6h(ng/L)24(ng/L)3d(ng/L)7d(ng/L)F(组间)P模型组(1)601.71±0.293.02±0.374.00±0.303.35±0.32针刺组(2)601.74±0.312.59±0.273.31±0.382.01±0.385.310.001空白组(3)121.74±0.361.78±0.321.79±0.311.77±0.31F(时点)63.43P<0.01

2.2.2 进一步对交互项进行分析结果

控制组别这一变量，观察时点上的差异：观察时点为6 h(0.25 d)时，三组间无差异(F=0.03,P=0.97>0.05),而24 h(1 d)、3 d、7 d三个时间点，三组差异均具有统计学意(P<0.001),通过比较均值，可见模型组24 h(1 d)、3 d、7 d三个时间点均高于针刺组，可见针刺组治疗有效。

表3 固定组别，分析时间效应

控制时间比较组别差异：模型组和针刺组，各时点间浓度值差别均具有统计学意义(P<0.01)，各时点间CD62p浓度变化趋势均为先升后降(峰值在3 d处)。空白对照组各时点之间CD62p浓度差别无统计学意义(F=0.92,P>0.05),时点间浓度值变化波动不大。

表4 固定时间，分析组别效应

3 讨论

近年来，在出血性脑卒中疾病机制中，血小板凝集，血栓的形成，脑出血后炎症细胞的浸润，为脑出血早期的治疗和预防带来了新的影响。在此过程当中，血小板跨膜糖蛋白在血小板的附着，聚集，粘附作用是炎性反应的关键点。

P-选择素主要分布于胞内贮存颗粒即血小板α颗粒及内皮细胞的Weibel-Palade小体, 又见于微静脉、小静脉的内皮细胞中[8]。在与凝血酶，组胺，补体及活性氧反应的过程中，P-选择素与浆膜融合，而在浆膜表面表达，在上述反应约20min后表达量下降，有部分P-选择素释放入血液中。高表达的P-选择素介导血小板，内皮细胞粘附，启动炎症反应，与血栓形成有密切关系。选择素发挥作用需要与相应的配体相互反应，配体包括糖类配体和蛋白类配体两部分[9]。在生理反应过程中，P-选择素的配体一般都是糖蛋白，选择素配体是多种多样的。参与的反应也不同。P选择素与配体相结合，在脑出血类疾病当中，主要参与的过程有，脑出血的炎症过程(介导炎症过程中白细胞的起始粘附)，缺血再灌注损伤过程以及血栓的形成等。

在脑出血后的炎症反应，白细胞穿越血管壁进入组织间隙，此过程为最重要的病理过程。其过程主要有：白细胞的滚动、 激活和紧密黏附、 移行[10]。

P选择素在这个过程中参与炎症反应的起始过程(白细胞在内皮上的滚动)。因此干预P选择素的表达，或者抑制其与配体的结合，是抑制脑出血后炎症反应，阻止脑出血后脑组织进一步损伤的重要思路。P选择素也可以作为早起血栓形成，以及炎症反应的重要标志物。

本实验ELISA 结果显示CD62p在脑出血后表达明显升高，说明了血小板膜上的CD62p表达开始增高，是反应脑出血后炎症反应严重程度的表现。CD62p的表达在脑出血后第3天达到高峰，随后开始下降，为正态分布形式。而空白组的CD62p表达含量明显低于脑出血组和针刺组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.01)。经过针刺治疗的大鼠，在各个时间段，CD62p的表达含量较脑出血组都有不同程度的降低，且差异具有统计学意义(P<0.01)。经观察，随着炎症反应的进行，CD62p在血清中的表达变化，观察到大鼠的神经功能缺损体征也随之加重或减轻。因此可以证明本次课题的结论，“百会透曲鬓”对抑制脑出血后炎症反应有一定的作用，减轻脑组织的进一步损伤。即通过抑制炎症反应，减轻脑出血后一系列脑组织的损伤反应，减轻神经功能的损伤。研究针刺对脑出血的治疗作用，为脑出血的治疗及后期复恢提供了新的思路，也验证了针刺治疗脑出血的明确作用。为今后临床治疗和药物的研发提供了新的方向。

近年来，中医治疗脑出血及其后遗症方面有了很大的进展。针灸作为一种治疗手段，在临床和实验方面都取得了良好的效果[11-13]。针灸的作用原理研究是针灸学与现代科学的观念与技术相结合的产物，研究和实践明确了针灸对疾病的作用其生物效应的机理。

本课题以CD62p为检测指标，观察“百会透曲鬓”针刺法对急性脑出血后炎症反应的作用，证明了针刺对缓解抑制大鼠脑出血后炎症有一定的作用，进一步明确了头针治疗大鼠急性脑出血的机理和疗效。为脑出血的研究和临床的治疗指明了新的方向，提供了新的成果。

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Expression of CD62p in Acute Cerebral Hemorrhage Rats Intervened by Acupunture of Baihui-to-Qubin

GUAN Rui-qiao1, ZOU Wei2, YU Xue-ping2, SUN Xiao-wei2, DAI Xiao-hong2,TENG Wei2, ZHANG Xin2, YUAN Meng-fei1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To investigate the effectiveness of acupuncture to the inflammation after cerebral hemorrhage through observing the influence of the expression of CD62p after acute cerebral hemorrhage in rats by acupuncturing Baihui-to-Qubin. Methods：132 Male Wistar rats were randomly divided into the blank group(12 rats), the model group(60 rats), and the acupuncture group(60 rats), of which the last two groups were randomly and evenly divided into four sub-groups as different time point: 6 h, 24 h, 3 d, and 7 d. Acupuncture group was treated by acupuncture at different time, whereas the blank group and the model group were not intervened. After treatment, the scores of nerve function were assessed at different points of time, and serum levels of CD62p were detected in each group with ELISA method. Results:The neurological impairment was significantly alleviated after acupuncture treatment compared to the model group at the same time point (P<0.01). ELISA result: The expression of CD62p in the rats' brain which have cerebral hemorrhage was obviously higher than that of the blank group, and the difference was statistically significant (P<0.01); CD62p expression of the acupuncture group was obviously lower than that of the model group at the same time point (P<0.01); The expression of CD62p reached the peak on the 3rd day after operation, there was a significant difference compared to the other time point (P<0.01). Conclusion：Acupuncture of Baihui-to-Qubin can obviously raise the scores of nerve function，and have the benefit for improvement of extremity function after cerebral hemorrhage. Also, this treatment can suppress the expression of CD62p in the membranes of blood platelets, to restrain the formation of encephaledema and inhibit the inflammation reaction.

Acupuncture therapy of Baihui-to-Qubin; Acute cerebral hemorrhage; Inflammation reaction; CD62p

2016-08-20

2017-03-20

国家自然科学基金面上项目(81273824)；黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD201204)；教育部博士点基金(20102327110003)；教育部春晖计划项目(Z2007-1-15010)

关瑞桥(1989-)， 女，博士研究生 ，研究方向：神经系统疑难杂病。

*通讯作者：邹伟(1965-)，男，主任医师，教授，博士研究生导师，研究方向：神经系统疑难杂病。

R245.32+1

A

1002-2392(2017)04-0074-05