急性心肌梗死和急性脑梗死miRNA疾病标志物的初步筛查

杜守治，董斌，齐中华

（大连医科大学1.附属第二医院创伤急症中心，辽宁 大连 116027；2.附属第一医院神经内科，辽宁 大连 116011）

急性心肌梗死和急性脑梗死miRNA疾病标志物的初步筛查

杜守治1，董斌2，齐中华2

（大连医科大学1.附属第二医院创伤急症中心，辽宁 大连 116027；2.附属第一医院神经内科，辽宁 大连 116011）

目的确定一种可以作为急性心肌梗死（AMI）或急性脑梗死（ACI）疾病诊断标志物的新的miRNA组合。方法根据文献与公开的互联网数据库，选择高频出现的miRNA做为候选基因，收集AMI患者外周血样本13例、ACI患者外周血样本11例和健康志愿者样本20例。利用试剂盒提取这些样本中的游离RNA，进行反转录及实时定量PCR测定，检测所有样本中候选miRNA的表达情况。对2个疾病组和健康对照组中候选miRNA的表达差异进行统计学分析。结果经过筛查，AMI组中出现频率最高的miRNA有miRNA1、miRNA499a和miRNA133a，ACI组中出现频率最高的miRNA有let7i、miRNA16和miRNA223。2个疾病组中6种miRNA的表达量均显著高于健康对照组（P＜0.01）。AMI组miRNA1和miRNA499a的表达量分别为ACI组的4.82倍和3.50倍（P＜0.01），而miRNA133a的表达量无统计学差异（P＞0.05）。ACI组与AMI组比较，miRNA16和miRNA233的表达量无统计学差异（P＞0.05），ACI组let7i的表达量为AMI组的2.61倍（P＜0.05）。结论人外周血游离RNA中6种miRNA均异常升高可以作为AMI或ACI的初步诊断标志物，在此基础上，miRNA1和miRNA499a的表达量达到11～20倍以上时，对AMI的发病具有辅助诊断及预警作用；let7i的表达量达到6倍以上时，对ACI的发病具有辅助诊断及预警作用。

急性心肌梗死；急性脑梗塞；miRNA；疾病标志物

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一种全球范围内高发的死亡率极高的心血管疾病［1］。动脉粥样硬化导致的冠状动脉管腔闭塞和斑块破裂是AMI发病的常见原因。另外，发病过程中心肌细胞坏死、凋亡以及随后的过度炎症反应也是AMI病理过程中心肌细胞损伤减少的主要原因［2］。急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）曾是全世界排名第二位的致死原因，在二十世纪九十年代的10年间曾导致400万人死亡［3］。首发ACI即使治愈仍经常伴有高复发率、神经功能障碍后遗症等，给患者造成长期的生理和心理上的创伤。AMI和ACI虽然临床表现形式不相同，但是发病过程存在很多相似之处，且血小板功能异常是这些疾病发生发展的重要机制之［4-5］。

微小RNA（miRNA）是一类内源性非编码小RNA分子，成熟的miRNA长度约为17～25个核苷酸，作为其他RNAs的反义调节因子，在调节细胞生命过程的表观遗传学如增殖、凋亡、分化和迁移等方面发挥重要作用［6］。已有研究［7-8］证实miRNA是潜在的肿瘤标志物，而且miRNA在血浆或血清长期储存或反复冻融后非常稳定，可以在新鲜或储存的外周血标本中测得可靠的表达量［9］。因此，一些研究者分别对AMI和ACI患者进行外周血中miRNA标志物的筛查，并得到了相关的结论［10-11］。不过由于2种疾病的发病机制既有相似之处，也有不同之处，所以这2种疾病的诸多miRNA标志物不相同或不具有特异性。因此，本研究将已有的文献报道与公开的互联网数据库相结合，选出几种候选miRNA，通过检测候选miRNA在健康志愿者和临床病例样本中的表达差异，进一步明确AMI和ACI的外周血miRNA标志物，为2种疾病的早期筛查、辅助诊断提供新的更可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

外周血游离总RNA提取试剂盒miRNeasy Serum/Plasma Kit Print（德国QIAGEN公司），反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit、实时PCR试剂盒SYBR®Fast qPCR Mix（大连宝生物），反转录和实时PCR的引物设计及合成由中国广州锐博生物有限公司完成；TP600型梯度PCR仪（日本TaKaRa公司），ABI7500实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技中国有限公司），HITACHI CF16RX-Ⅱ高速离心机（日本日立公司）。

1.2 候选基因筛选方法

查阅文献及公开的互联网数据库，选择高频出现的miRNA做为候选基因。文献来源为中国知网数据库（http：//www.cnki.net/）及 PubMed数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/），公开的互联网数据库为miRWalk数据库（http：//zmf.umm.uniheidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/documentation.html）。待测样本来源为2016年1月至12月期间于大连医科大学附属第一医院和附属第二医院确诊为AMI和ACI的住院患者及体检中心健康志愿者的外周血，包括AMI患者13例，ACI患者11例，健康志愿者20例，外周血采血时间均为住院1 h内。

1.3 提取外周血游离RNA操作步骤

外周血游离总RNA的提取分为两部分。首先制备血清样本，用含有促凝剂的采血试管收集全血10 mL，室温下（15～25℃）静置10 min，4℃下1 900 g离心10 min，吸取上部液体血清到尖底EP管中，4℃下16 000g离心10 min，吸取上清液到一个新管中，该上清液即为含有游离miRNA的总RNA血清样本。然后从该血清样本中提取含有游离miRNA的总RNA，具体操作参见QIAGEN公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit Print试剂盒说明书。

1.4 反转录及实时PCR程序设定

检测miRNA表达的方法为先反转录后实时PCR法。反转录温度设置条件为42℃ 60 min→85℃ 5 s→4℃。实时PCR法温度设置条件为95℃ 5 min，95℃ 5 s→57℃ 30 s→70℃ 30 s（45个循环），95℃ 5 s→55℃ 30 s→95℃ 5 s。加样量根据说明书，并用U6基因做内参照进行平行操作，采用2-ΔΔCt法表示各组基因差异表达的倍数关系。

1.5 统计学分析

2 结果

经过筛选，AMI组中出现频率最高的miRNA有miRNA1、miRNA499a和miRNA133a，ACI组中出现频率最高的 miRNA有 let7i、miRNA16和 miRNA223。分别检测上述几种miRNA在3组样本中的表达差异，结果显示，AMI组和ACI组中6种miRNA的表达量均显著高于健康对照组（P＜0.01）。为了进一步确认哪种miRNA在AMI和ACI 2种疾病中有差异表达，进行了AMI组和ACI组的组间比较。由于miRNA1、miRNA499a和miRNA133a在AMI组的表达量高于ACI组，因此选择AMI组/ACI组的比值以便于比较。AMI组miRNA1和miRNA499a的表达量分别为ACI组的4.82倍和3.50（P＜0.01），而miRNA133a表达量无统计学差异（P＞0.05）。由于miRNA16、miRNA223和let7i在ACI组的表达量高于AMI组，因此选择ACI组/AMI组的比值以便于比较。ACI组miRNA16和miRNA233的表达量与AMI组比较无统计学差异（P＞0.05），let7i的表达量为AMI组的2.61倍（P＜0.05）。见表1。

与健康对照组比较，这6种miRNA在AMI组和ACI组的表达量均显著增高，提示2种疾病可能存在某些相同的发病机制，6种miRNA可以作为2种疾病的候选疾病标志物。其中表达量增加最大的是AMI组的miRNA499a，而miRNA16在AMI组和ACI组的表达量均显著增加。通过AMI组/ACI组的比值可以看出，虽然miRNA1和miRNA499a在2种疾病发生时均高表达，但是AMI组的miRNA1和miRNA499a的表达量仍显著高于ACI组，提示外周血游离的这2种miRNA表达量分别达到健康水平的2～6倍时，是一种特异性不强的AMI或ACI标志物，但表达量达到11～20倍以上时，可能是特异的AMI候选疾病标志物。与此相似，let7i的表达量达到健康水平的2～3倍时是一种特异性不强的AMI或ACI标志物，但表达量达到6倍以上时，可能是特异的ACI候选疾病标志物。

表1 6种miRNA在AMI组、ACI组和健康对照组表达差异的比较Tab.1 Comparison of the six miRNAs in the AMI，ACI，and control groups

图1清晰表示了每个疾病样本中的6种miRNA在本组疾病和另外一种疾病中的差异表达。其中图1A、1B和1F中，miRNA表达量在2种疾病的分布位置差异较大，而图1C、1D和1E中miRNA表达量在2种疾病的分布位置比较接近。进一步表明miRNA1、miRNA499a在AMI组的表达强度远高于ACI组，而let7i在ACI组的表达强度远高于AMI组。

3 讨论

本研究显示，作为候选标志物，miRNA1、miRNA499a、miRNA133a、miRNA16、miRNA223和let7i在筛选过程中不只出现在AMI或ACI这2种疾病中的一种。有报道显示，miRNA499a等在心绞痛及心肌梗死中表达异常降低［12］，let7i还在胃癌组织中显著低表达［13］。本研究中，检测2种疾病患者的血液样本时，与健康对照组样本相比6种miRNA均出现表达异常升高的现象。所以利用一组miRNA对疾病进行预测，比用单一miRNA可靠性更强，同时还要结合其他信息如心电图或排除肿瘤疾病等，才能获得更准确的诊断结果。这6种miRNA可以以一种组合的形式，初步作为AMI或ACI的诊断标志物，为临床诊断提供新的依据。这与已有的研究［14-16］结果相符。外周血游离的miRNA中，在6种miRNA均出现表达异常升高的基础上，miRNA1和miRNA499a的表达达到正常值的11～20倍以上时，提示患者可能是AMI发病，而不是ACI；同样在6种miRNA均出现了表达异常升高的情况下，let7i的表达达到正常值的6倍以上时，提示患者可能是ACI发病，而不是AMI。

需要指出的是，miRNA发挥生理作用的方式为转录后调控作用，其作用机制复杂，比较常见的机制是miRNA与Argonaute蛋白结合，组合成为RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。形成的基因沉默复合体RISC会通过碱基互补配对与mRNA的3’非翻译区结合，然后抑制其翻译或者直接将其降解。这取决于miRNA与mRNA的互补程度。如果miRNA与靶mRNA碱基完全互补，就会引发mRNA的降解，这种现象在植物中常见；如果miRNA与靶基因不完全互补，就会抑制mRNA的翻译，这种现象在动物中较常见。并且一种miRNA可以参与调控多种信号通路的转导，同时一条信号通路也可受到多种miRNA的调控［17］。

以miRNA作为早期疾病标志物的研究还显示，由于外周血中的游离miRNA是病灶部位的细胞凋亡、坏死后释放进入外周血液循环或以外泌体形式、游离单细胞形式进入外周血液循环，在发病的不同时间段，病灶部位细胞自身表达可能不同，则血液中同一种miRNA的表达量在发病的不同时间段也不同［18］。因此，将外周血游离RNA中一种miRNA的异常表达作为单一特定疾病的确诊指标尚需结合临床实际深入考察，但是一组调控机制相关的miRNA集体异常表达，在肿瘤、AMI、ACI等多种重大疾病的患病风险评估及预后方面正在发挥越来越重要的作用［19-20］。

图1 各样本所含的6种miRNA在AMI组和ACI组表达的差异Fig.1 Differences in the expression of the six miRNAs between the AMI and ACI groups

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（编辑 陈 姜）

Preliminary Screening of miRNA Disease Markers for Acute Myocardial and Cerebral Infarctions

DU Shouzhi1，DONG Bin2，QI Zhonghua2

（1.Emergency and Critical Care Medicine Center，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China；2.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo identify a new miRNA combination that could be used as a diagnostic marker for acute myocardial infarction（AMI）or acute cerebral infarction（ACI）.MethodsWe surveyed the literatures and databases and selected miRNAs with a high frequency in AMI or ACI as candidate genes.We collected peripheral blood samples from 13 patients with AMI，11 patients with ACI，and 20 healthy volunteers.RNA was extracted from these samples，and gene expression levels were determined by reverse transcription and real-time quantitative PCR.The differences in the expression of the candidate miRNAs were then analyzed.ResultsThe frequencies of miRNA1，miRNA499a，and miRNA133a were higher in the AMI group，whereas the frequencies of let7i，miRNA16，and miRNA223 were higher in the ACI group.These six miRNAs were significantly higher in the two disease groups than in the control group（P＜0.01）.The levels of miRNA1 and miRNA499a were 4.82-and 3.50-times higher in the AMI group，respectively（bothP＜0.01），when compared with the ACI group.The levels of let7i in the ACI group were 2.61-times higher than that in the AMI group（P＜0.05）.There were no significant differences in the expression levels of miRNA133a，miRNA16，and miRNA233 between the AMI and ACI groups（P＞0.05）.ConclusionThe abnormal increase in six miRNAs in human peripheral blood could be used as a marker for the diagnosis of AMI or ACI.The expression levels of miRNA1 and miRNA499a were 11-to 20-times higher than control levels，and the expression levels of let7i were 6-times higher than control levels，which could be used to predict the risk of AMI and ACI，respectively.

acute myocardial infarction；acute cerebral infarction；miRNA；disease marker

R542.2；R743.33

A

0258-4646（2017）08-0681-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.003

国家自然科学基金（81672968）

杜守治（1980-），男，主治医师，硕士研究生.

齐中华，E-mail：qzhdl770716@126.com

2017-04-14

网络出版时间：