贵州不同居群滇重楼引种后种质变化研究

吴平+周单单+段雪滢+潘伟+沈昱翔

摘要：研究了贵州不同居群滇重楼引种后物候期、产量和有效成分的变化。采用观察法记录引种后的物候期变化；采用切割法测定其根状茎增长速率；采用HPLC法测定其药材中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的含量。结果表明：滇重楼引种后物候期有一定变化，倒苗期提前尤为明显；根状茎生物量增长率相近；引种后药材中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的含量差异不显著，但有增加的趋势；滇重楼倒苗期受环境影响明显；根茎生长速率与栽培环境关系密切；而有效成分含量亦是环境因素主导。通过改变可控因素（环境因子）来对滇重楼进行优质高产栽培是可行的途径。

关键词：HPLC；滇重楼；引种；品质评价

中图分类号：S567

文献标识码：A 文章编号：16749944（2017）15011803

1 引言

滇重楼（Paris polyphylla Smith var yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.）为延龄草科重楼属植物，分布于我国云南、贵州等省[1]。滇重楼是著名药用植物，以根茎入药，为《中国药典》2015版收载重楼基源之一[2]，传统医学认为其具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊的功效，临床广泛运用于疔疮痈肿，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐等症，疗效确切[3]。现代研究表明，滇重楼根茎含有多种甾体皂苷，具有止血、镇痛、抗炎、修复胃粘膜损伤等作用[4～6]，近年来还报道其具有抗肿瘤的活性[7]。2015年版中国药典规定了薯蓣皂苷类重楼Ⅰ、Ⅱ和偏诺皂苷类化合物Ⅵ、Ⅶ的含量测定方法及限度用以全面反映重楼内在质量。由于近年来重楼的需求迅速增长，重楼野生资源急剧减少。本文对不同居群样品药材进行收集和引种栽培，采用高效液相色谱等方法对引种栽培前后的滇重楼药材进行品质评价，考察环境对滇重楼栽培适应度、产量和有效成分的影响，为人工栽培滇重楼替代野生资源，满足市场需求奠定基础。

2 仪器与试剂

2.1 药材来源

收集的滇重楼样品涵盖了贵州具有滇重楼种群自然分布的地区，样品均为自采或购买具有地上部分植株，便于鉴定的样品。标本存放于安顺学院标本室。

2.2 引种苗圃详细信息

每个产地滇重楼除干燥部分作为药材样品保存外，将带顶芽根茎作为种源引种栽培于位于安顺学院苗圃中。栽培基质选用混合均一的山基土与废弃菌包，搭建荫棚以模拟其自然生境栽培并对其进行物候期观察，于2015年11月采挖栽培两年后样品，对进行其有效成分等进行评价。

2.3 仪器与试剂

高效液相色谱仪（美国Water）、分析天平、微型植物試样粉碎机、自动进样器，超纯水，乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ对照品购自中国食品药品检定研究院（批号分别为111590-200402，111591-200402，111592-200402，111593-200402）。

3 方法与结果

3.1 物候期观察

在栽培期间，对引种成活后植株的出苗时间、花期、果熟期、倒苗期进行观察并记录，每个产地至少记录10株，取平均值。

3.2 根茎生物量累计速率的测定

滇重楼根茎生长速率f=近2年根茎重量/前2年根茎数量，结果见表1。

3.3 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量测定

色谱条件为 AgelaVenusilXBP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-水（B），进行梯度洗脱（0～40 min、30%～60%A，40～50 min、60%～30%A）检测波长203 nm；柱温25 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。取混合对照品和供试品溶液分别进样，理论板数按重楼皂苷Ⅰ的的峰计算≥4×103（图1），精密吸取混合对照品溶液，分别进样4、6、8、10、12、14 μL，记录峰面积。以对照品进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算各产地的滇重楼的回归方程（表2）。精密称取22份不同产地的滇重楼样品粉末月0.5 g，平行称取3份按照上述方法测定样品中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量，测定结果见（表2）。

3.4 对引种前后的数据进行相关性分析

使用SPSS软件对滇重楼引种前后4种皂苷含量和总皂含量进行方差分析，数据表明引种后滇重楼中皂苷含量差异不显著但均有增加的趋势，结果见表3。

4 讨论

于2014年至2015年两年时间内，对滇重楼引种后主要物候特征、生物学性状进行了观察记录，发现滇重楼栽培过程中不同居群植株表现出一定物候期的差异，这些差异并未随着栽培的时间表现出显著趋同性，表明不同居群间物候期差异存在，且这些特性可能是遗传主导型；倒苗期较野生居群提前近30 d，其他物候期基本没变化，故此推断可能会影响根茎生物量的累计，因此对引种的样品根茎增长速率f值进行测量和计算后，发现样品根茎都能够正常增重，f≥1，最高值f=1.33；且整体根茎生物量累计速率有趋同的趋势，提示滇重楼根茎生物量累计可能与栽培环境关系密切。

实验以甲醇-乙腈流动相体系梯度洗脱所得到的色谱图基线比较平稳，色谱峰数较多，分离效果好、灵敏度高；由表3可知，不同产地不同居群滇重楼药材品质存在较大差异，其中总皂苷含量最高的是产自其中兴义市乌沙镇舍格村；结果表明，贵州省滇重楼资源品质具有如下特点：其一是其有效成分含相对较高，且品质稳定，本实验对22份样品中的4种重楼皂苷进行了含量测定，达到药典要求的有产自贵定县都六乡的样品2、产自兴义市乌沙镇的样品5以及普定县鸡场乡的样品7三个品质最好，4种皂苷总含量超过2%；贵州省滇重楼4种皂苷总含量平均值为1.23%，高于药典要求值（0.60%）1倍有余；其二是它的自然分布环境海拔较云南等地低，仅1000余m海拔即可适应生长，并且对海拔、土壤、光照、水分等生态因子不甚严苛生态幅较大。

不同产地滇重楼药材中有效成分的含量引种前后有一定差异；通过测量引种前后有效成分含量变化发现，滇重楼在合适的栽培条件下，有效成分含量有增高趋势，但差异显著，引种栽培后绝大部分样品能满足药典要求，说明人工栽培滇重楼提供药用切实可行；但4种重楼皂苷含量变化并无显著规律，可能是由于测试样品的样本之间个体差异造成，但是整体而言，有效成分含量在栽培过程中也表现出趨同的趋势。本研究将不同居群滇重楼引种到相同环境，进行了长达两年的栽培和观察，得出滇重楼有效成分含量是受环境因素主导，因此提示我们可以通过改变可控因素（各环境因子）来对滇重楼进行栽培以达到优质高产的目的。

参考文献：

[1]李 恒.重楼属植物[M].北京：科学出版社，1998：35～37.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M] .北京：中国医药科技出版社，2015：243～244.

[3]何 俊，张 舒，王 红，等.滇重楼植物的研究进展[J].云南植物研究，2006，28（3）：271～276.

[4]Chen CX，Zhang YT，Zhou J.Studies of the saponin components of plants in YunnanⅥ ：Steroid glycosides of Paris polyphylla var yunnanensis [J].Acta Bot Yunnan，1983，5（1）：91～97.

[5] Chert CX，Zhou J，1992.Two new steroid saponins of Paris polyphylla var yunnanensis [J].Acta Bot Yunnan，14（1）：111～113.

[6]张宵霖，刘月婵.重楼的研究与应用[J].中国中医药科技，2000，7（5）：346～347.

[7]石小枫，杜德极.重楼总皂甙H22动物移植性肿瘤的影响[J].中草药，1992，15（3）：33～36.

Abstract：Abstract Objective：To study the changes of phenological period、yield and content of active ingredient after the introduction of different paris polyphylla var.yunnanensis in Guizhou.Methods：The morphological changes were record by observational method；The growth rate of rhizome were determined by cutting method；The content of Saponins Ⅰ、 Ⅱ、Ⅵ and Ⅶ variety in paris polyphylla var.yunnanensis were determined by HPLC.results：The phenological pheriod of the paris polyphylla var.yunnanensis had certain change after the introduction and withering stage is especially obvious in advance； the growth rate of rhizomes biomass were close；The contents of Saponins Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ and Ⅶ were not varies greatly.Conclusion：The withering stage of the paris polyphylla var.yunnanensis were affected significantly by surroundings； It is concluded that the growth rate of rhizome is closely related to the cultivation surroundings，and the active ingredient content is also affected by the environmental factor.Therefore，it is a feasible way to achieve the purpose of excellent production for paris polyphylla var.yunnanensis by changing the controllable factors （environmental factors）.

Key words： HPLC；Paris polyphylla var yunnanensis；Domestication；quality evaluation