卵巢癌细胞自噬后4种miRNAs表达变化及miR-144对mTOR的靶向调控作用

盛红娜，王艳丽，吴璠，赵采云，李晶

(天津医科大学第二医院，天津300211)

·基础研究·

卵巢癌细胞自噬后4种miRNAs表达变化及miR-144对mTOR的靶向调控作用

盛红娜，王艳丽，吴璠，赵采云，李晶

(天津医科大学第二医院，天津300211)

目的 观察雷帕霉素诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬后miR-18a、miR-19a、miR-21及miR-144表达的变化，并以miR-144为研究对象，验证其对自噬相关基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(mTOR)的靶向调控作用。方法 分别用50 ng/mL雷帕霉素(雷帕霉素组)及10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA组)作用于SKOV3细胞2、12 h，收集细胞，并设立不进行任何处理的细胞作为对照组，提取总RNA;应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测4种miRNAs的表达水平。培养SKOV3细胞，设立正常细胞组、miR-144 mimic组和miR-144 inhibitor组，分别将合成的miR-144 mimic及miR-144 inhibitor转染到SKOV3细胞内，正常细胞组不处理。应用qRT-PCR方法检测各组的miR-144及mTOR mRNA表达量，应用Western blotting法检测各组细胞中mTOR蛋白表达量。应用双荧光素酶报告系统验证miR-144与mTOR的相互作用关系。结果 对照组细胞miR-18a、miR-19a、miR-21及miR-144的表达量分别为1.003±0.021、1.001±0.039、1.014±0.016、1.028±0.037；雷帕霉素组4种miRNAs的表达量分别为6.310±0.025、1.200±0.058、52.310±0.005、63.490±0.024，其miR-18a、miR-21及miR-144高于对照组(P均<0.05)；3-MA组SKOV-3细胞的4种miRNAs的表达量分别为0.540±0.019、0.890±0.062、0.820±0.012和0.660±0.003，其miR-18a及miR-144低于对照组(P均<0.05)。与正常细胞组比较，miR-144 mimic组miR-144 mRNA表达量高(P<0.05)，mTOR mRNA和蛋白的表达量降低(P均<0.05)；miR-144 inhibitor组miR-144表达量下降(P<0.05)，mTOR mRNA和蛋白的表达量升高(P均<0.05)。miR-144 mimic分别与mTOR-WT及mTOR-Mut共转染，前者的荧光表达量低于后者(P均<0.05)。结论 SKOV3细胞发生自噬后，miR-18a、miR-21及miR-144表达升高， miR-144可靶向抑制mTOR的表达。

卵巢肿瘤；微小RNA-144；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；细胞自噬

卵巢癌是目前最为常见的女性生殖系统三大恶性肿瘤，高于70%的患者确诊时已属晚期，是目前病死率最高的妇科肿瘤[1]。该病易转移、易复发，且对化疗易产生耐药，其疗效及远期预后较差，5年生存率仅为30%左右[2]。微小RNA(miRNA)是一类内源性的非编码小分子RNA，其主要在基因转录后水平对靶基因进行调控，影响众多重要的生物学过程。目前已证实miRNA与多种肿瘤的发病密切相关。自噬是一种高度保守的，可使溶酶体降解的生物学代谢过程，该过程主要通过吞噬自身细胞质蛋白或细胞器，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，进而降解其所包裹的内容物,使得某些肿瘤细胞凋亡或对抗自身环境来逃避凋亡[3]。自噬的发生离不开自噬相关蛋白的调控，主要蛋白包括：ATG5、ATG12、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(mTOR)及Beclin1等。当机体细胞癌变后，多种自噬相关蛋白发生变化，直接或间接地影响肿瘤的发病过程。近年来，关于miRNAs对卵巢癌细胞自噬调控的研究逐渐增多，已被证实的对卵巢癌细胞自噬具有调控作用的miRNAs包括miR-30d、miR-29b及miR-152[4～6]。2016年1～10月，基于miRNA、自噬以及卵巢癌三者之间的相互作用关系，本课题应用雷帕霉素诱导自噬，同时应用3-甲基腺嘌吟(3-MA)抑制自噬，最终筛选出miR-144可能对卵巢癌的细胞自噬起着调控作用，通过一系列生物信息学试验，验证miR-144与潜在靶基因mTOR的相互作用关系，为进一步研究miR-144对卵巢癌细胞自噬的调控作用奠定理论依据，为卵巢癌的基因诊断及基因治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 卵巢癌细胞株 SKOV3 购于中国科学院上海细胞库；质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自天根生化技术有限公司；限制性内切酶购自大连宝生物技术有限公司；Western blotting所用一抗购自Abgent公司；双荧光素酶检测试剂盒及反转录试剂盒购自Promega公司；胎牛血清及DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；雷帕霉素购自上海前尘生物科技公司；3-MA购自Sigma公司；miR-18a、miR-19a、miR-21、miR-144、mTOR及mTOR/mut引物由上海华大基因公司合成； miR-144 mimic/inhibitor引物序列由上海吉玛公司合成。

1.2 细胞培养及处理 应用10%胎牛血清的DMEM培养基,37 ℃、5%CO2及100%饱和湿度的培养箱培养SKOV3细胞。将培养好的细胞接种于12孔板培养瓶中，待细胞生长汇合至75%～85%时，分别进行以下处理：雷帕霉素50 ng/mL(雷帕霉素组)反应2 h、3-MA 10 nmol/L(3-MA组)反应12 h，对照组细胞不经过任何处理。

1.3 各组miRNAs表达量的检测 提取各组细胞中的RNA,应用茎环引物进行逆转录，茎环引物分别为：miR-18a：5′CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-CAATTCAGTTGAGCTATCTGCACTAGATG3′；miR-19a：5′CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGT-TGAGTCAGTTTTGCATA3′；miR-21：5′CTCAACTGGTGTCGTGGACTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC3′；miR-144：5′CTCAACTGGTGTCGTGGACTCGGCAATTCAGTTGAGAGTACATC3′；应用qRT-PCR方法检测各组细胞内miRNAs的表达量，qRT-PCR特异性引物序列分别为：miR-18a：5′ACACTCCAGCTGGGTAAGGTGCATCTAGTGCAGA3′；miR-19a：5′ACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCTATGCAAAAC3′；miR-21：5′ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGATG3′；miR-144：5′ACACTCCAGCTGGGTACAGTATACATGATGTACT3′)。以U6为对比内参，以2-ΔΔCt法计算目的基因表达量。

1.4 SKOV3细胞中miR-144、mTOR mRNA及mTOR蛋白表达的检测 培养SKOV3细胞，设立正常细胞组、miR-144 mimic和miR-144 inhibitor组：分别将合成的miR-144 mimic及miR-144 inhibitor转染到SKOV3细胞内，正常细胞组不处理。提取各组细胞的总RNA，逆转录后应用qRT-PCR方法检测各组miR-144及mTOR mRNA表达水平。试验重复3次。分别提取各组细胞的蛋白质，BCA法测定蛋白浓度，等量上样，应用Western blotting法检测各组细胞中mTOR的蛋白水平。

1.5 pMIR-Report载体构建与鉴定 应用TargetScan、miRanda等生物信息学软件进行miR-144的靶基因预测。选定mTOR作为预测靶基因，构建pMIR-Report-mTOR-3′UTR(mTOR-WT)及其突变(mTOR-Mut)的重组质粒，酶切及测序验证结果。

1.6 miR-144与靶基因mTOR 3′UTR的靶向作用验证 采用双荧光素酶报告基因检测系统。将NC/mTOR-WT、NC/mTOR-Mut及miR-144 mimic/mTOR-WT、miR-144 mimic/mTOR-Mut转染到HEK-293T细胞中，以海肾荧光素酶作为内参，转染48 h后，加入反应试剂，在荧光倒置显微镜下观察转染细胞的发光情况，于微孔板发光分析仪检测其活性，每组试验重复3次。

2 结果

2.1 三组SKOV3细胞4种miRNAs的表达水平比较 见表1。

表1 各组SKOV3细胞miRNAs的表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 三组miR-144 mRNA相对表达量比较 正常细胞组miR-144 mRNA表达量为1.01±0.022，miR-144 mimic组为6.9±0.012，miR-144 inhibitor组为0.24±0.003，三组间比较，P均<0.05。

2.3 三组mTOR mRNA及蛋白的相对表达量比较 正常细胞组的mTOR mRNA表达量为1.00±0.02， miR-144 mimic组为0.15±0.00，miR-144 inhibitor组为2.01±0.00。正常细胞组中mTOR蛋白表达水平为78.33±0.24， miR-144 mimic组为22.56±0.11，miR-144 inhibitor组为225.89±0.68。与正常细胞组比较，miR-144 mimic组mTOR mRNA及蛋白表达水平降低，miR-144 inhibitor组升高(P均<0.05)。

2.4 miR-144对靶基因mTOR 3′UTR的靶向作用 microRNA网络数据库显示，miR-144在mTOR mRNA的3′UTR上有碱基互补配对位点。NC/mTOR-WT的荧光表达量为54.10±0.23，NC/mTOR-Mut为57.2±0.31，二者相比，P>0.05；miR-144 mimic/mTOR-WT荧光表达量为9.88±0.07，miR-144 mimic/mTOR-Mut为56.10±0.19，两者比较,P<0.05。

3 讨论

mTOR是PI3k/Akt信号通路下游一个高度保守的调控分子，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族成员。其主要参与细胞的生长、细胞周期进程及蛋白质合成等生物学过程，可通过调控其下游的核糖体蛋白激酶活性，来影响自噬的发生。有研究者发现，当机体的癌症相关基因PTEN被敲除或持续性激活Akt基因后，mTOR可调控FOXP3的表达，抑制Treg的分化，干扰肿瘤发生[7]；mTOR可促进起始蛋白翻译，诱导肿瘤增殖，通过作用于胰岛素样生长因子-1，使得E-钙黏附蛋白表达增多，从而促进卵巢癌细胞生长[8]。

miRNA是一类小分子RNA，其主要的生物学功能是通过与靶基因的3′UTR相互结合，导致基因表达受到影响。目前已有大量研究报道关于miRNAs与卵巢癌的相互作用关系，例如：在卵巢癌A2780细胞系及OV8细胞系中，miR-9的表达较正常组织相比明显异常，并证实miR-9通过影响E-钙黏蛋白的表达，干预卵巢癌上皮间质细胞的转化[9]。Zhao等[10]研究者发现，miR-203可通过抑制p53蛋白的表达，促进卵巢癌细胞的增殖与迁移;miR-203还可通过调控丙酮酸脱氢酶B，促进机体的糖酵解。Kleemann等[11]研究结果证实，miR-1912、miR-147b及miR-3073a在卵巢癌细胞系中表达异常，三种小分子可增强凋亡信号通路的活性，诱导促凋亡分子Bak1及Bax的表达;同时影响抑制凋亡的相关基因，如Bcl-2及Bcl-xL的表达。针对卵巢癌药物敏感性的研究中，发现miR-100通过抑制mTOR及PLK1基因的表达，抑制肿瘤细胞增殖、影响细胞周期，且可促进肿瘤细胞凋亡[12]。

本研究结果显示，经雷帕霉素处理后的SKOV3细胞中miR-144的表达明显上调，说明miR-144可能对SKOV3细胞的自噬过程存在潜在的调控作用。通过转染miR-144 mimic，使得细胞内miR-144呈过表达状态，此时细胞内mTOR mRNA及蛋白质的表达水平明显降低；而转染了miR-144 inhibitor后，miR-144的表达减少的同时，mTOR mRNA和蛋白质的表达水平有所升高；说明miR-144的表达水平明显影响了mTOR的表达。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-144与mTOR-WT共转染后，荧光表达量明显降低，而将miR-144 mimic同mTOR-Mut相结合，荧光表达量无明显变化，此实验结果进一步说明， miR-144与mTOR具有靶向作用关系。因此，miR-144很可能通过靶向抑制mTOR的表达水平来影响卵巢癌细胞的自噬过程。该实验结果为诊断和预防卵巢癌的标志物研究提供了新的靶点，为治疗卵巢癌的药物研究开拓新的思路。

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