肤宁洗剂微生物限度检查方法的建立及验证

汪琦 李雄英 吴智娟 黄巧玲

肤宁洗剂微生物限度检查方法的建立及验证

汪琦 李雄英 吴智娟 黄巧玲

肤宁洗剂；微生物限度；检查方法

肤宁洗剂是由黄柏、白鲜皮、白芷、地肤子等中药制成的复方制剂，具有清热燥湿、祛风止痒的功效，用于急性皮炎、湿疹伴有渗出或脓性分泌物等治疗。按照其用药途径，根据2015年版《中国药典》（四部）[1]相关规定，微生物限度检查应进行需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定，及金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的检查。为使供试品的微生物得到真实反映，必须使其在该检验条件下的样品浓度不足以抑制污染微生物的生长，从而保证检验结果的科学性和准确性[2－3]。在对肤宁洗剂进行微生物限度检查时发现其有一定的抑菌作用，故建立肤宁洗剂的微生物限度检查方法并对其进行验证试验，从而为同类药物的微生物限度检查提供科学的试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器高压蒸汽灭菌器、电热恒温鼓风干燥箱、恒温电热培养箱、生物安全柜、红外灭菌器。

1.2 培养基胰酪大豆胨液体培养基（批号：151027）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号150825）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号150801）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号150806）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号150801）、pH7．0氯化钠－蛋白胨缓冲液（批号140508）。以上培养基均购买自北京路桥技术股份有限公司，并且通过2015版《中国药典》所规定的相关适用性试验，按使用说明书配制。

1.3 供试品肤宁洗剂（批号160222，160223，151006），杭州市第三人民医院制剂中心。

1.4 试验用菌株及菌液制备金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】、枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】、黑曲霉菌【CMCC（F）98003】。

以上菌种均由浙江省食品药品检验研究院提供，传代次数均为第5代。

2 方法学验证试验

2.1 菌液制备取经33℃培养18～24h后的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培养物1个白金耳，用0．9%无菌氯化钠溶液稀释成每1mL含50～100cfu的菌悬液；取经23℃培养48～72h后白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物1个白金耳，用0．9%无菌氯化钠溶液稀释成每1mL含50～100cfu的菌悬液；取经23℃培养120～168h后的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，用3mL 0．9%氯化钠溶液将孢子洗脱，再用无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用0．9%无菌氯化钠溶液稀释成每1mL含50～100cfu的孢子悬液。金黄色葡萄球菌菌液取10－7稀释级，铜绿假单胞菌菌液取10－6稀释级，枯草芽孢杆菌菌液取10－6稀释级、白色念珠菌菌液取10－6稀释级、黑曲霉菌菌液取10－4稀释级。

2.2 供试液的制备量取供试品10mL，加pH7．0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100mL，制成1：10的供试液。

2.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的验证

2.3.1 试验组（1）平皿法：取已制备的供试液1mL，及五种试验菌菌液，分别注入平皿中，迅速倒入45℃完全溶化的相应培养基15～20mL，每株菌平行制备2个平皿，待冷凝后，置所需温度下倒扣培养至规定的时间，观察计数。（2）培养基稀释法：取已制备的供试液0．2mL及五种试验菌菌液，其余方法同平皿法。（3）薄膜过滤法：取标号A、B、C、D、E五个锥形瓶，加0．9%无菌氯化钠溶液50mL，将制备好的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液各0．1mL分别置A、B、C、D、E五个锥形瓶中，混匀。用少量冲洗液润湿滤膜，取供试液1mL用薄膜过滤法滤过。取总量200mL0．9%无菌氯化钠溶液冲洗供试品，最后分别将A、B、C、D、E五个锥形瓶内的菌悬液倒入滤筒，滤过。测定需氧菌总数：转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行两份，置33℃培养箱培养至规定的时间，观察计数。测定霉菌和酵母菌总数：转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行两份，置23℃培养箱培养至规定的时间，观察计数。

2.3.2 菌液组取pH7．0氯化钠－蛋白胨缓冲液替代供试品溶液，同试验组操作。

2.3.3 供试品对照组取制备好的供试液1mL，不加菌液，同试验组操作。试验组的菌落回收率（%）=

2.4 控制菌检查法验证

2.4.1 试验组（1）常规法：取已制备的供试液各10mL，分别至盛有100mL胰酪大豆胨液体培养基两个锥形瓶中，再加入50～100cfu金黄色葡萄球菌菌及铜绿假单胞菌菌悬液各1mL，于33℃培养24h。取上述培养物分别划线接种至甘露醇氯化钠琼脂培养基及溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，于33℃培养24h。观察结果。（2）薄膜过滤法：取已制备的供试液各10mL，用薄膜过滤法过滤，再用0．9%无菌氯化钠溶液总量为200mL冲洗，将膜取出，置于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，再加50～100cfu金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌菌悬液各1mL，其余与同常规法。

2.4.2 供试品对照组不加菌液，方法同试验组。

2.4.3 阴性对照组以10mL稀释液代替供试品，方法同试验组。

3 结果

按平皿法、培养基稀释法及薄膜过滤法三种方法测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数中的供试品对照组的菌落数，在规定条件下培养。结果三种方法中3个批次药品的供试品对照组本底组菌落数均为零。

按平皿法、培养基稀释法及薄膜过滤法三种方法测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数中的试验组及菌液中的菌落数，在规定条件下培养。结果平皿法及培养基稀释法中五种阳性菌种的回收率均低于0．5，低于2015版《中国药典》规定的0．5～2的回收率，而薄膜过滤法的五种阳性菌种的回收率均在0．5～2的范围内。说明该产品具有抑菌作用，可采用薄膜过滤法进行该产品的微生物限度检查。见表1。

采用常规法及薄膜过滤法对控制菌的检查，结果常规法中试验组、供试品对照组及阴性对照组三批次肤宁洗剂中均未检出金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌；而薄膜过滤法中试验组三批次肤宁洗剂中检出金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌，均为（++），供试品对照组及阴性对照组三批次肤宁洗剂中均未检出金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌。

4 讨论

肤宁洗剂含有多种中药成分，据文献[4－8]报道，黄柏、白鲜皮、地肤子均有不同程度的抑菌作用。其中任何一味中药具有的抑菌作用均可能影响该制剂微生物限度检查的准确性，但其抑菌作用对该制剂的微生物限度检查到底有多大影响则无法确定，故采取2015年版《中国药典》规定的三种方法对其进行验证试验，来确定最为合适的检查方法。平皿法常用于无抑菌作用及抑菌作用较弱的药物，对抑菌作用较强或强的药物一般采用培养基稀释法及薄膜过滤法[9－10]。为了药品的检出结果可靠、准确、无假阴性，应在检验前消除其自身的抑菌作用所造成的干扰。实验结果表明，在需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定中，肤宁洗剂对五种阳性菌均具有不同程度的抑菌作用。采用平皿法及培养基稀释法检查均达不到2015年版《中国药典》的规定，而采用薄膜过滤法则可消除肤宁洗剂的抑菌作用从而达到规定；控制菌检查中常规法未检测出金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌，而薄膜过滤法可检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，故本制剂的控制菌检查选用薄膜过滤法。

表1 三种方法阳性菌菌落数及回收率结果（cfu/mL，）

表1 三种方法阳性菌菌落数及回收率结果（cfu/mL，）

方法平皿法组别试验组菌液组菌种160222需氧菌霉菌和酵母菌试验组菌液组回收率160223试验组菌液组回收率151006培养基稀释法试验组菌液组回收率160222试验组菌液组回收率160223试验组菌液组回收率151006薄膜过滤法试验组菌液组回收率160222试验组菌液组回收率160223试验组菌液组回收率151006回收率金黄色葡萄球菌21．0±11．382．5±4．90．323．5±6．489．5±9．20．316．0±7．188．0±9．90．234．5±3．588．5±4．90．432．5±3．591．0±4．20．430．5±2．185．5±12．00．482．5±6．487．0±5．70．980．0±11．381．5±3．51．081．0±11．376．5±3．51．1铜绿假单胞菌20．5±0．784．0±7．10．321．0±2．888．5±2．10．323．0±12．783．5±7．80．331．5±3．592．0±7．10．432．0±7．189．5±9．20．426．0±2．882．5±4．90．480．5±7．885．5±3．50．981．5±7．876．0±4．21．181．0±8．587．5±6．41枯草芽孢杆菌21．0±2．886．0±9．90．319．5±3．579．5±6．40．319．5±0．781．0±8．50．329．0±5．786．5±12．00．427．0±2．880．5±2．10．432．5±2．188．5±2．10．467．0±4．285．5±9．20．872．5±9．282．5±13．40．979．0±8．578．5±13．41．1白色念珠菌16．5±3．589．0±8．50．221．5±2．182．5±4．90．321．0±4．274．0±7．10．330．5±4．987．5±4．90．424．0±2．886．0±11．30．330．5±4．983．5±7．80．490．5±6．480．5±3．51．270．0±8．577．5±7．80．974．5±10．681．0±12．71黑曲霉菌9．5±0．773．5±7．80．214．0±1．472．5±6．40．212．0±4．271．5±4．90．218．0±1．475．0±4．20．322．5±2．176．0±9．90．322．5±6．477．5±4．90．361．5±7．871．0±2．80．959．5±3．571．0±11．30．961．0±5．770．0±1．40．9白色念珠菌15．0±2．875．5±9．20．220．0±1．476．0±4．20．319．0±1．479．5±6．40．327．0±4．290．0±5．70．325．5±4．991．5±6．40．332．5±4．988．5±4．90．481．5±3．584．5±6．4167．0±7．179．5±3．50．971．0±12．792．5±4．90．8黑曲霉菌11．5±2．171．0±4．20．210．5±2．165．5±3．50．212．5±2．173．0±5．70．225．5±6．480．5±2．10．425．5±2．172．5±6．40．420．5±4．971．0±5．70．366．5±4．974．5±4．90．963．0±5．758．0±4．21．158．5±4．967．0±5．70．9

通过验证试验得出，肤宁洗剂的微生物限度检查方法中，需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数及控制菌检查均宜采用薄膜过滤法。

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（收稿：2016-12-25修回：2017-01-10）

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