Mob1a真核表达载体构建方法及对MEN通路基因表达的影响研究

郝涛，马冲，李保松，刘春远，蒋宏

（滨州医学院附属医院结直肠腹壁疝外科，山东滨州256600）

Mob1a真核表达载体构建方法及对MEN通路基因表达的影响研究

郝涛，马冲，李保松，刘春远，蒋宏

（滨州医学院附属医院结直肠腹壁疝外科，山东滨州256600）

目的探讨Mobla真核表达载体构建方法及对MEN通路基因表达的影响。方法利用PCR扩增技术扩增出Mobla编码基因，将其构建到真核表达Mobla载体上，利用脂质体将构建的真核表达载体瞬时转染干细胞，采用Western blot检测Mobla蛋白是否表达，采用荧光素梅报告基因实验对MEN通路基因表达活性的影响。结果本研究成功构建Mobla真核载体，经过小鼠肝脏细胞转染后能对其蛋白质进行提取，Western blot显示：Mobla质粒在小鼠肝脏细胞中表达水平未见异常。荧光素酶报告基因试验进结果显示：Mobla能抑制MEN通路基因信号，能抑制TNF-a刺激引起的MEN通路转录活性。结论采用PCR扩增技术能成功扩增、构建出Mobla真核表达载体，并且对MEN通路基因表达存在一定的影响。

Mobla真核表达；构建方法；MEN通路；基因表达；PCR扩增技术

有丝分裂是一个多因素过程，如果有丝分裂调控中存在明显的差错后，将会引起肿瘤[1]。有丝分裂退出途径（Mitotic Exit Network，MEN）是一种相对完整的控制信号，能有效的调整信号的分裂退出途径，并且经过联级放大后能有效的对有丝分裂的终末进行有效的控制[2]。但是，细胞有丝分裂后期需要在纺锤体下进行基因的重新组合，此时MEN则能激活退出信号，完成核定位操作，完成有丝分裂的退出[3]。细胞有丝分裂过程中，Dbf2-Mob1之间相互作用，磷酸化的Dbf2-Mob1作为效应器促进下游反应[4]。

在芽殖酵母中，Mob1蛋白是有丝分裂退出途径的重要因子，并可调节胞质分裂。在人类癌细胞中，hMOB1的过表达激活LATS活性，抑制细胞增殖或引起凋亡。相反，短发夹（sh）RNA抑制hMOB1引起细胞增殖增加[5]。肝癌是人类癌症死亡的第三大原因，患者预后较差，死亡率较高。目前对于Mob1a-shRNA真核表达载体，研究其在体外对肝细胞分裂的影响缺乏报道。本研究探讨Mobla真核表达载体构建方法及对MEN通路基因表达的影响，为肝癌的基因治疗提供了新的思路和方法。

1 资料与方法

1.1 主要仪器和试剂为了保证试验的顺利完成，采用的主要仪器和试剂主要由CR及酶切产物纯化试剂盒（Promega公司）、质粒DNA小量提取试剂盒（Promega公司）、转染试剂Lipofectamine2000（Invitrogen公司）、CL显色剂（Pierce）、双荧光素酶检测试剂盒（Invitrogen公司）、ECL显影试剂（北京威格拉斯生物技术公司）等。

1.2 方法利用PCR扩增技术扩增出Mobla编码基因，将其构建到真核表达Mobla载体上，利用脂质体将构建的真核表达载体瞬时转染干细胞，采用Western blot检测Mobla蛋白是否表达，采用荧光素酶报告基因实验对MEN通路基因表达活性的影响。

1.3 统计学方法采用SPSS 18.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用“n（%）”表示，计量资料行t检验，采用“x±s”表示，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增出Mobla真核载体通过获得Mobla真核序列，并且根据相关引物的长度设计有关引物，并且从既往报道中找出编码基因，基恩GG一系列处理后完成真核表达的构建，结果显示：本课题中成功构建Mobla真核载体。见图1。2.2Mobla在真核细胞中的表达Western blot检测结果显示：Mobla质粒在小鼠肝脏细胞中表达水平未见异常。见图1、图2。

2.3 Mobla真核能负调节MEN通路基因Mobla真核载体构建后，容易引起细胞内信号之间进行相应的传递，使得MEN通路基因发生明显的变化。本课题中为了进一步了解Mobla真核构建后对MEN通路基因表达的影响，采用荧光素酶报告基因试验进行验证，结果显示：Mobla能抑制MEN基因信号通路，能抑制TNF-a刺激引起的MEN通路转录活性。见图2。

图1 PCR扩增出Mobla真核载体Figure 1 PCR was amplified by Mobla eukaryotic vector

图2 Mobla真核能负调节MEN通路基因Figure 2 Mobla,true nuclear energy,negative regulation,MEN pathway,gene

3 讨论

Mobl基因最早在芽殖酵母中发现，在细胞的有丝分裂中发挥了重要的作用，能有效的参与、调节细胞的分裂和增殖[6]。有丝分裂必须经过信号复合物的组装，这一过程的调控严格受时间和空间的控制。有丝分裂调控出错则引发肿瘤发生（tumorigenesis）。在芽殖酵母中，有丝分裂退出途径(Mitotic Exit Network,MEN)是一套控制有丝分裂退出的信号途径。在有丝分裂后期，MEN信号复合物触发有丝分裂退出的信号。其中，磷酸化的Dbf2-Mob1作为效应器促进下游反应。但是，哺乳动物肝细胞中这一通路如何发挥效应尚属未知。本研究发现Mobla能抑制MEN通路基因信号通路，能抑制TNF-a刺激引起的MEN通路转录活性。

目前，临床上对于Mobl的功能尚不完全知晓，除了能实现MEN的调控外，还具备其他重要的功能。Hippo信号通路控制器官大小和组织内稳态，其失调与人类癌症有关。Mobl构成哺乳动物肝脏中Hippo信号传导的关键中枢，限制肝细胞生长和维持肝细胞干/祖细胞静止[7]。LATS激酶级联是Hippo通路的核心。Mob1促进LATS多步、顺序过程的激活并有效地耦合同一级联中两个激酶的激活[8]hMOB1A可以作为肿瘤抑制剂在人类癌细胞中起作用[5,9]。MOB1A在黑素瘤和乳腺癌细胞系发生突变，在结肠直肠、非小细胞肺癌、皮肤癌中hMOB1下调或缺失。小鼠肝脏中的Mob1a/1b双缺陷（LMob1DKO）导致超过一半的突变小鼠在出生的3周内死亡，所有幸存者最终发展为肝癌。Mob1a/1b的缺失是小鼠肝脏肿瘤发生的重要驱动因子[10]。但是目前Mob1在人类肝癌发生发展中的作用机制目前报道尚少。本课题以Mob1a基因作为肝细胞的有丝分裂生的靶基因，为肝细胞的有丝分裂研究提供了新的思路和方法，也为进一步研究应用控制MEN通路进行肝癌的基因治疗奠定了实验基础。

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Construction of Mob1a eukaryotic expression vector and its effect on MEN pathway gene expression

Hao Tao,Ma Chong,Li Bao-song,Liu Chun-yuan,Jiang Hong
(Department of Colorectal Hernia Surgery,Affiliated Hospital of Binzhou Medical College,Binzhou,Shandong,256600,China)

Objective To investigate the effects of Mobla eukaryotic expression vector construction method and the expression of MEN pathway genes.Methods PCR amplified Mobla gene encoding by PCR,cloned into eukaryotic expression vector Mobla,to construct the eukaryotic expression vector transfected stem cells by liposome was detected by Mobla Western blot is the expression,activity of fluorescent reporter gene expression on Al MEN pathway genes.Results This study successfully constructed Mobla eukaryotic vector after transfection in mouse liver cells can be carried out after the protein Western extraction,blot showed that the expression level of Mobla plasmid showed no abnormalities in mouse liver.The luciferase reporter gene into test results showed that Mobla could inhibit MEN signaling pathway genes,can inhibit the TNF-a pathway induced by stimulation of MEN transcriptional activity.Conclusion Using PCR amplification technique can be successfully amplified,construct the eukaryoticexpression vector Mobla and the expression of MEN pathway genes have a certain influence.

Mobla eukaryotic expression;Construction method;MEN pathway;gene expression;PCR

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.23.004

滨州市科技发展计划（2014ZC0110）