HPLC法测定脂溶性维生素注射液中维生素D2及维生素E的含量

陈光

[摘要] 目的 建立测定脂溶性维生素注射液中维生素D2、维生素E的高效液相色谱（HPIC）分析方法。 方法 应用高效液相色谱法。维生素D2采用Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm）色谱柱：以正已烷：异丙醇（97.5：2.5）为流动相：流速为1ml/min）：检测波长为265nm：柱温室温：紫外测器。维生素E采用Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm）色谱柱：以正已烷-异丙醇（99.5∶0.5）为流动相：流速为1mL/min：检测波长为298nm：柱温室温：紫外检测器。结果 维生素D2和维生素E分别在0.26～2.08?g/mL和0.64～3.20mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。维生素D2和维生素E的平均回收率分别为98.90%、100.2%、RSD分别为1.2%、1.1%。结论 本方法准确、快速、重现性好。

[关键词] 维生素D2；维生素E；高效液相色谱法；含量测定

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）15-46-05

[Abstract ] Objective To develop the HPLC method for determination of vitamin D2，vitamin E content in the Fat-soluble vitamin injection. Methods High performance liquid chromatography（HPLC） was used.Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm） chromatographic column was used to determine vitamin D2，n-hexane： isopropanol（97.5：2.5） was as mobile phase，the flow rate was 1ml/min，wavelength was 265nm，under the condition of room temperature，and UV-detector were used.Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm） chromatographic column was used to determine vitamin E：n-hexane：isopropanol（99.5∶0.5） was as mobile phase，the flow rate was 1ml/min，the wavelength was 298nm，under the condition of room temperature，and UV-detector were used. Results There was a good linear relationship between the 0.26-2.08?g/mL range and peak area for vitamin D2，while the 0.64-320?g/mL range for vitamin E.The average recovery rate of vitamin D2 and vitamin E were 98.90% and 100.2%.RSD of vitamin D2 and vitamin E were 1.2% and 1.1%. Conclusion The method is accurate，rapid and reproducible.

[Key words] Vitamin D2；Vitamin E；Chromatography（HPLC）；Determination

脂溶性維生素注射液为含有维生素A、维生素D2、维生素E、维生素K1和注射用大豆油，卵磷脂等的灭菌乳剂，属维生素类药。用于脂溶性维生素缺乏的预防和治疗。其中维生素D又称钙化醇，维生素D种类很多。以维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇）较为重要。维生素D的主要生理功能是：调节钙、磷代谢、促进钙、磷吸收。缺乏时，儿童和哺乳期妇女更为明显。维生素E[1-3]又名生育粉，维生素E有很强的抗氧化作用。同时具有提高维生素A功能的作用；维生素E缺乏将导致红血球被破坏。肌肉的变性。贫血症，生殖机能障碍等病变[4-6]，由于维生素E结构复杂，异构体多，准确分析测定较困难，近年来许多科学家致力于其分析的研究，开发了很多实用高效的检测方法，既有物理和化学方法，也有仪器分析方法 ，既有维生素E的总含量检测，也有异构体含量检测等。随着多种复合维生素药物的广泛应用，建立对这些维生素及其它成分的简单、快速、准确的分析方法是非常必要的，高效液相色谱（HPLC）法是目前使用最普遍的测定维生素类的方法，应用广泛。维生素是维护人体健康、促进生长发育和调节生理机能所必需的一类有机化合物，通常按溶解性把维生素分为脂溶性和水溶性两大类。

在参阅国内有关报道[8-15]的基础上，我们用高效液相色谱法测定了溶脂性维生素注射液中的维生素D2和维生素E含量。

1 仪器与试药

KQ-250E 型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）：FA1100型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）：日立U-3010型紫外可见分光光度计：高效液相色谱仪，工作站及紫外检测器（美国Agilent公司）；RE52-1旋转蒸发器（上海沪西分析仪器厂）。正已烷（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；已丙醇（色谱纯，Fisher公司）：无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）：水为超纯水。脂溶性维生素注射液，自制（批号20130224，20130410，20130415，20130420）；维生素D2对照品（中国药品生物制品检定所，批号10155-0004）：维生素E 对照品（中国药品生物制品检定所，批号10062-0007）。

2 实验方法[7]

2.1 维生素D2方法学考察

2.1.1 维生素D2对照品溶液的制备 精密称取维生素D2对照品5.20mg，用正已烷溶解并定溶至10mL，再移取1.0mL定溶至100mL，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取脂溶性维生素注射液10.0mL，加30mL无水乙醇摇匀，再用正已烷萃取三次，每次40mL，合并正已烷层，35℃减压发挥至油状残渣，用正已烷溶解定溶至5mL，即得。

2.1.3 维生素D2检测波长的确定 取对照品溶液适量，在200～600nm进行紫外扫描，结果在265nm有量大吸收，因此确定检测波长为265 nm。

2.1.4 色谱条件及系统适用性实验 色谱柱：Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm）：流动相：正已烷：异丙醇（97.5：2.5）；体积流量：1.0mL/min：检测波长：265nm：柱温：室温：检测器：紫外检测器。

2.1.5 专属性实验 取阴性溶液，供试品溶液及对照品溶液20?L进样，结果在供试品色谱中，在与对照品主峰相应位置处有明显色谱峰，而阴性溶液色谱中则无此峰，表明此方法的专属性良好。

2.2 维生素E方法学考察

2.2.1 维生素E对照品溶液的制备 精密称取维生素E对照品4.00mg用正已烷溶解并定容至50mL，制得浓度为0.08mg/mL的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取脂溶性维生素注射液10.0mL，加无水乙醇约15mL摇匀，正已烷萃取三次，每次20mL，合并正已烷层，35℃ 减压挥发至油状残渣，用正已烷溶解并定至5mL，再从中精密量取1mL定溶至100mL，即得。

2.2.3 维生素E检测波长的确定 取对照品溶液适量，在200～600nm进行波长扫描，结果在298nm有最大吸收，因此求确定检测波长为298 nm。

2.2.4 维生素E色谱条件及系统适用性实验 色谱柱：Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm）：流动相：正已烷-异丙醇（99.5：0.5）：体积流量：1.0mL/min：检测波长：298nm：柱温：室温：检测器：紫外检测器：在此条件下，维生素E的理论塔板数为17732，邻杂质峰的分离度为：3.31，且峰形较好，系统适用性考察结果符合药典要求。

2.2.5 专属性试验 取阴性溶液，供试品溶液及对照溶液各10?L进样。结果在供试品色谱中，在与对照品主峰相应位置处有明显色谱峰，而阴性溶液色谱中则无此峰，表明此方法的专属性良好。

3 结果

3.1 维生素 D2试验结果

3.1.1 线性关系考察 参照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VID）实验。精密吸取对照品溶液0.5、1、2、3、4mL，加甲醇稀释至10mL，混匀。分别吸取不同浓度的对照品溶液依次注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以维生素D2浓度与峰面积进行线性回归。得维生素D2回归方程Y=38.423Х-0.85，相关系数r=0.9999。结果表明：维生素D2在0.26～2.08?g/mL范围内成良好线性关系。

3.1.2 稳定性考察 精密吸取线性关系考察中的对照品溶液 （浓度为1.04 ?g/mL）20?L分别于0h、1h、2h、4h、8h进样。记录维生素D2峰面积，结果表明供试品溶液在8h内稳定，能满足测定要求。

3.1.3 重复性考察 精密吸取线性关系考察中对照品溶液（浓度为1.56?g/mL），柱入液相色谱仪，记录维生素D2峰面积，结果表明仪器的精密度良好。

3.1.4 中间精密度考察 对同一批制剂，在3天内不同的时间，由不同操作者，不同仪器。采用不同的色谱条件（Alltima Silica 250mm×4.6mm：Kromasil 100-5sil 250mm×4.6mm）及样品处理方法测定维生素D2的浓度，结果表明本方法的中间精密度良好。

3.1.5 重现性考察 平行取脂溶性维生素注射液5份，按供试品制备方法处理，并测定维生素D2含量，结果RSD=1.2%，表明本方法的重现性良好。

3.1.6 加样回收实验[4] 称取已知含量的脂溶性维生素注射液（批号：20130224 维生素D2 0.52?g/mL）加入维生素 D2适量。如法测定含量，计算回收率。结果见表1～6。方法学考察结论：维生素D2在0.26～2.08 ?g/mL范围内，线性相关性。精密度。准确度均良好。而且样品的稳定性、方法的重现性均能满足测定要求。

3.1.7 维生素D2含量测定 取三批产品（批号：20130410，20130415，20130420）各三个样品。按供试品制备方法制备，精密量取20 ?L， 注入液相色谱仪，记录峰面积，计算样品浓度，三批样品浓度均在标示量的 90%～110%之间，含量稳定，表明制剂工艺已基本稳定。

3.2 VE试验结果

3.2.1 线性关系考察 参照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VID试验，精密量取维生素E对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别置于10mL容量瓶中，用正已烷定容至刻度。分别吸取不同浓度的对照品溶液依次柱入高效液相色谱仪，测定峰面积，以维生素E浓度与峰面积进行线性回归，得维生素E回归方程Y=8.2938Х+1.45，相关系数r=0.9999，结果表明：维生素E在0.46～3.20?g/mL范圍内成良好线性关系。

3.2.2 稳定性考察 精密量取供试品10?L分别于0h、1h、2h、4h、8h末进样，测定峰面积，结果表明：供试品在8h内稳定。能满足测定要求。

3.2.3 重复性考察 精密吸取线性关系考察中浓度为24.0?g/mL的对照品，注入液相色谱仪，记录维生素E的峰面积，结果表明仪器的精密度良好。

3.2.4 中间精密度考察 对同一批制剂，在3天内不同的时间，由不同操作者，不同仪器，采用不同的色谱条件（Alltima Silica 250×4.6mm，5um：Kromasil 100-5sil 250×4.6mm）及样品处理方法测定维生素E的浓度，结果表明本方法的中间精密度良好。

3.2.5 重现性考察 按供试品制备方法对一批5个小试产品进行处理，然后各精密量取10?L，注入色谱仪，记录峰面积，计算样品浓度。

3.2.6 加入回收实验[4] 称取已知含量的脂溶性维生素注射液（批号：20130224，维生素E含量920.5?g/mL），加入维生素E适量，如法测定含量。计算回收率，结果见表2～6。由表13可知本测定方法的回收率高，符合含量测定的要求。方法学考察结论：维生素E在8.0～40.0?g/mL浓度范围内，线性相关性，精密度，准确度，均良好，而且样品的稳定性，方法的重现性均能满足测定要求。

3.2.7 含量测定 取三批产品（20130410，20130415，20130420）各三个样品，按供试品制备方法制备，精密量取20?L，注入液相色谱仪，记录峰面积。计算样品浓度。三批样品浓度均在标示量的90%～110%之间。含量稳定。表明制剂工艺已基本稳定。

4 讨论

本实验采用 HPLC 法直接测定脂溶性维生素注射液中维生素D2，维生素E的含量。方法简便、准确、快速。可作为该制剂中维生素D2，维生素E的含量控制方法。维生素D2和维生素E的吸收波长分别是265、298nm，试验的稳定性和重复性较好。维生素D2在0.26/～2.08?g/mL范围内，维生素E在8.0～40.0?g/mL浓度范围内，线性相关性，精密度，准确度，均良好，而且样品的稳定性，方法的重现性均能满足测定要求。

本实验对脂溶性维生素注射液的提取做了一些改进，以前采用提取异丙醇的方法，但异丙醇提取液放置一段时间后会分层，影响测定。虽然维生素D2，维生素E为脂溶性，但制剂中表现为水包油型，所以无法用正已烷萃取的方法进行提取。因此我们采用无水乙醇溶解，正已烷萃取的方法进行提取。由于分析纯正已烷存在比较明显的杂质峰，对结果测定影响明显。所以，在整个定容过程中应使用色谱纯正已烷定容，以保证样品的重现性和色谱柱的分类效能。

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（收稿日期：2017-05-26）