南方典型旅游城市空气微生物特征研究

方治国,黄 闯,楼秀芹,李睿哲,姚文冲



南方典型旅游城市空气微生物特征研究

方治国1*,黄 闯1,楼秀芹2,李睿哲1,姚文冲1

(1.浙江工商大学环境科学与工程学院,浙江杭州 310018；2.杭州市疾病预防控制中心微生物检验科,浙江杭州 310021)

选取杭州市4个样点进行了空气微生物取样,利用传统可培养法系统研究了其空气微生物特征.结果表明杭州市空气微生物总浓度变化范围为24~10135CFU/m3.均值为1140CFU/m3,空气细菌浓度变化范围为0~3253CFU/m3,均值为292CFU/m3,空气真菌浓度变化范围为0~8767CFU/m3,均值为848CFU/m3.空气真菌浓度显著高于细菌浓度.空气细菌和真菌浓度百分比分别为29.1%和70.9%.杭州市不同样点空气微生物中浓度显著不同,ZJGSUJC最高为1413CFU/m3,其次为YRBS(1174CFU/m3)和BLQG(1137CFU/m3), TJCR最低为834CFU/m3.杭州室外优势细菌属依次为微球菌属()、芽孢杆菌属()、葡萄球菌属()、库克菌属()和假单胞菌属(), 5属细菌百分比总和约占55.26%~59.48%.优势真菌属依次为青霉属()、枝孢属()、链格孢属()、无孢菌和曲霉属(),分别约占总数的29.49%、21.43%、10.98%、10.88%和7.74%.本研究提供了杭州市空气微生物污染的第一手资料,为城市管理部门制定相关的环境政策法规提供理论指导,也为全面掌握我国城市空气微生物特征奠定基础.

南方典型旅游城市；空气微生物；生物气溶胶；优势菌属；群落特征

空气中广泛分布的细菌、真菌孢子、放线菌和病毒等微生物粒子,不仅具有重要生态功能,而且还与空气环境质量以及人类健康等密切相关[1-2].由生物粒子组成的气溶胶,可间接作为云凝结核和冰核,导致云滴和冰晶的形成,在雨雪的形成过程中发挥着非常重要的功能,并且可通过直接散射或吸收太阳能辐射在全球气候变化中起着至关重要的作用[3-5].然而,作为空气污染表征体系的一部分,生物气溶胶对评价空气污染的致病性和过敏性具有重要的作用,小部分具有活性的生物气溶胶能够导致各种微生物疾病发生,比如结核病、细菌性肺炎、球孢子菌病、流行性感冒、胃肠道疾病和麻疹等[6].空气中微生物的致病性是造成流行性疾病暴发的主要原因之一,它们往往比化学污染更加难以预防和控制[7].因此,空气中生物污染物的种类、浓度及分布特征开始受到研究人员的高度重视.近年来流行性疾病的爆发更加让我们意识到开展城市空气微生物污染特征研究的重要性和紧迫性.

2001年,美国政府制定了生物监测计划;2002年,Shelton等[8]报道了美国不同区域室内外空气真菌的群落特征及浓度分布特点,2004年,美国科学家呼吁调查所有美国城市的空气细菌群落以及利用基因芯片技术建立国家级空气细菌数据库[9].与国外相应的研究相比,我国城市空气微生物的研究起步较晚.20世纪80年代末至90年代,胡庆轩等用自然沉降法调查了北京、天津和沈阳等地区的空气生物污染特征[10-12].进入21世纪后,我国研究人员也意识到空气微生物研究工作的重要性和紧迫性,对北京、广州、南京、合肥等地区的空气微生物进行了深入的研究[13-19].近年来,由于全国范围内雾霾频发,污染空气中微生物群落特征及对人群健康的影响研究蓬勃发展,为特殊环境空气微生物特征的研究打下了坚实的基础.

杭州市是浙江省省会和全省经济、文化和科教中心,长江三角洲中心城市之一,国家历史文化名城和南方典型的风景旅游城市.杭州市空气微生物的研究可以使我们更加深入了解其功能,并掌握其在提高生态系统功能中的作用.然而,有关杭州空气微生物的研究工作至今仍为空白,论文以杭州市为例,通过定位观测和系统取样,研究了我国南方典型旅游城市空气微生物群落结构及浓度变化特征,可为城市空气微生物污染的控制和城市管理部门环境政策法规的制定提供理论指导.

1 材料与方法

1.1 研究样点概况

在南方典型旅游城市浙江省杭州市选取4个不同的功能区,即文教区、交通枢纽、商业区和旅游风景区,试验样点分别设置在浙江工商大学教工路校区(ZJGUSJC)、天目山路与教工路口(TJCR)、延安路商业街(YRBS)和西湖曲院风荷(BLQG),于2011年6月~2012年5月进行空气微生物特征研究,各样点的基本概况如表1.

表1 取样点基本概况

1.2 空气微生物取样器

采用国产Andersen生物粒子取样器(FA-1,辽阳应用技术研究所)进行空气微生物取样测定.它是模拟人呼吸道的解剖结构和空气动力学生理特征.采用惯性撞击原理设计制造的.该取样器分为6级,每级400个孔,从Ⅰ~Ⅵ级孔的直径逐渐缩小,空气流量为28.3L/min,每一级的空气流速逐次增大,从而把空气中的带菌粒子按大小不同分别捕获在各级培养皿上.取样器按粒径从大到小共分为6级为Ⅰ~Ⅵ级,其孔径分别为1.18、0.91、0.71、0.53、0.34、0.25mm,粒子的捕集范围分别为>8.2、5.0~10.4、3.0~6.0、2.0~3.5、1.0~2.0、<1.0µm,其有效截留粒子径分别为8.2、6.0、3.0、2.0、1.0、0.65µm.

1.3 取样和培养方法

选择相同的天气条件进行空气微生物的取样工作,实验过程中每月取样1次,每次连续取样3d,每天取样3次(9:00、13:00、17:00),每次3个重复.空气微生物的取样高度为人呼吸带,距离地面约1.5m处.采样器各层的孔眼至采样面的距离(即撞击距离)为2mm,室外空气微生物的取样时间为3min.取样采用直径为90mm的一次性塑料培养皿,预先在无菌条件下加入20~ 25mL已灭菌的微生物培养基,操作时尽量控制培养皿内培养基厚度的一致性,以减少试验的系统误差.空气细菌取样采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂15g,蒸馏水1000mL),采集的细菌样品在37 ℃培养箱内培养48h;空气真菌取样采用沙氏培养基(葡萄糖40g,蛋白胨10g,琼脂20g,蒸馏水1 000mL),加入氯霉素(0.05~0.125mg/mL)抑制细菌的生长,采集的真菌样品在25℃培养箱内培养72h,然后分别在各级取样培养皿上对微生物菌落进行记数、分离和纯化.

1.4 空气微生物浓度计算方法

由于通过Andersen 采样器各筛孔的微生物粒子,超过一定数量后,会出现微生物粒子通过同一筛孔撞击在同一点上的重叠现象,故各级采集的菌落数需经公式(1)校正:

式中:P为校正后的菌落数(i=1,2,3,4,5,6);为采样器各级采样孔数;为实际的菌落数.

空气细菌浓度的计算方法见式(2)和(3):

BC=BC1+BC2+ BC3+ BC4+ BC5+ BC6(3)

式中:BC为空气细菌总浓度,CFU/m3;BC(= 1,2,3,4,5,6)为取样器各级空气细菌浓度,CFU/m3; BP为取样器各级校正后的细菌菌落数,个;为采样时间,min;为空气流量,L/min.

空气真菌浓度的计算方法见式(4)和(5):

FC=FC1+ FC2+ FC3+ FC4+ FC5+ FC6(5)

式中:FC为空气真菌总浓度,FC(=1,2,3,4,5,6)为取样器各级空气真菌浓度; FP为取样器各级校正后的真菌菌落数;为采样时间;为空气流量.

空气微生物浓度的计算方法如公式(6):

MC=BC+FC (6)

式中:MC为空气微生物浓度,CFU/m3;BC为空气细菌总浓度,CFU/m3;FC为空气真菌总浓度, CFU/m3.

空气细菌和真菌浓度百分比计算方法见式(7)和(8):

BC=BC/MC×100% (7)

FC=FC/MC×100% (8)

式中:BC为空气细菌浓度百分比;FC为空气真菌浓度百分比.

1.5 空气微生物鉴定方法

1.5.1 空气细菌鉴定方法 分离纯化后的空气细菌采用分子生物学方法进行鉴定,采用细菌16S rDNA通用引物PCR扩增,纯化、送公司测序,再与NCBI数据库比对获得细菌相关菌种的信息,引物序列为:

27F: 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′,

1492R: 5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′.

1.5.2 空气真菌鉴定方法 根据真菌菌落形态和显微镜下真菌的孢子特征把空气真菌鉴定到属.借鉴国外学者经验,对在原培养基上培养3d未产生孢子的菌落如转种培养2周后仍未见孢子生成,则列入无孢菌群,简称为无孢菌.分离纯化后的空气真菌采用分子生物学方法进行鉴定,采用真核生物核糖体基因(rDNA)内转录间隔区(ITS)通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增、纯化、送公司测序,再与NCBI数据库比对获得真核生物相关信息,引物序列为:

F: ITS1 (5′- TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)

R: ITS4 (5′- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′).

1.6 统计分析和图表制作方法

本研究数据分析和图表绘制用SPSS Version 19.0和Microsoft Excel 2010 进行.

2 研究结果

2.1 杭州市空气微生物浓度分布特征

杭州市空气微生物、空气细菌和空气真菌的浓度均值分别为1140,292,848CFU/m3(表2),空气真菌浓度约为空气细菌浓度的2.9倍.从两者的中值来看,空气真菌浓度(550CFU/m3)约为空气细菌浓度(201CFU/m3)的2.7倍.

表2 杭州市空气微生物浓度特征(CFU/m3)

注:不同字母表示差异性显著.

2.2 杭州市不同样点空气细菌和真菌浓度百分比

杭州市空气细菌和真菌浓度分别占微生物总浓度的29.1%和70.9%(图1),空气细菌浓度百分比显著低于空气真菌(<0.01).从图1可以得出,不同取样点空气细菌和真菌浓度百分比差异不同.BLQG空气细菌和真菌浓度百分比差异最大,分别为21.0%和79.0%; YRBS差异最小,分别为41.1%和58.9%; ZJGSUJC分别为22.0%和78.0%,TJCR两者浓度百分比分别为32.5%和67.5%.

图中TJCR、ZJGUSJC、YRBS和BLQG分别为样点天目山路与教工路口、浙江工商大学教工路校区、延安路商业街、西湖曲院风荷,Total为总体分布数据,下同

2.3 杭州市空气微生物总浓度时空变化特征

2.3.1 不同取样点空气微生物总浓度 杭州市不同取样点空气微生物总浓度显著不相同(图2),ZJGSUJC的空气微生物总浓度最高为1413CFU/m3,其次为YRBS和BLQG,两者浓度分别为1174,1137CFU/m3,TJCR最低为834CFU/m3.

2.3.2 不同季节杭州市空气微生物总浓度 杭州市空气微生物季节变化特征显著(图3).从图中可以看出,不同样点冬季空气微生物总浓度显著低于其他季节(<0.01),4个取样点TJCR、ZJGSUJC、YRBS、BLQG冬季空气微生物浓度分别为497,575,669,573CFU/m3,没有显著差异. YRBS和TJCR空气微生物浓度在秋季达到最高值,分别为1724,1100CFU/m3; ZJGSUJC和BLQG则在夏季达到最高值,分别为1764, 1394CFU/m3.

2.4 杭州市空气微生物群落特征

在杭州市4个取样点共分离鉴定出789株55属184种空气细菌,其中革兰氏阳性菌和阴性菌分别占89.2%和10.8%.从鉴定出现频率来看,优势菌属依次为微球菌属()、芽孢杆菌属()、葡萄球菌属 ()、库克菌属 ()和假单胞菌属 (),5属细菌百分比总和约占55.26%~59.48%.在优势菌属中,微球菌属约占总数的13.13%~18.45%,芽孢杆菌属占11.17%~17.17%,葡萄球菌属占10.68%~ 12.63%,库克菌属占9.47%~14.08%,假单胞菌属占3.40%~6.57% (表3).

在分离纯化的352株真菌中,共鉴定出21属85种空气真菌.从不同真菌属浓度百分比看,杭州市优势空气真菌依次为青霉属(),枝孢属()、链格孢属()、无孢菌和曲霉属(),分别约占总数的29.49%、21.43%、10.98%、10.88%和7.74%.在分离纯化的菌种中,青霉属物种占有绝对的优势,其出现的次数占分离菌株总数的36.5%(表3).

表3 杭州市不同样点空气微生物群落特征(%)

续表3

3 讨论

在南方典型旅游城市杭州选取了4个样点,系统研究了杭州市室外空气微生物特征.结果发现,杭州市空气中微生物、细菌和真菌浓度分别为1140,292,848CFU/m3,空气中真菌浓度显著高于空气细菌(<0.01),真菌浓度约为细菌浓度的2.9倍.我国其他城市如广州市空气细菌和真菌浓度均值分别为1188,462CFU/m3[14],青岛市春季和夏季空气细菌和真菌浓度平均值约为439和524CFU/ m3[20],合肥市空气中微生物、细菌和真菌浓度分别为54150、50400和3750CFU/ m3[21];而世界其他地区如法国马赛城市空气细菌和真菌浓度分别约为791,63CFU/m3[22],澳大利亚墨尔本空气真菌浓度为1133CFU/m3.总体上说,杭州市室外空气细菌浓度相对较低,这与杭州市的气候特征及环境条件密切相关.图4显示了杭州和北京室内外空气微生物浓度分布特征,从图中可以看出,北京市室内外空气微生物总浓度和细菌浓度均显著高于杭州,而北京室内外空气真菌浓度与杭州没有显著差异[16-19,23-26].分析其原因,可能是由于我国南北方城市不同的气候特征及环境条件引起的.北京是我国典型的北方城市,首先其全年平均降雨量较少,空气相对湿度较低,这样空气中的细菌粒子通过雨水的冲刷作用降落到地面的现象就会减弱,会导致近地面空气细菌浓度增加;其次北京偶尔会有沙尘天气,冬季室外风较大,容易引起地上粘附细菌的较大尘埃粒子漂浮在近地面的空气中,这样就能够增加近地面空气中的细菌浓度;再次北京晚秋到初春室外气温较低,相应的绿化植物覆盖率相对较低,这样就减少了植物挥发性分泌物对空气中细菌的灭杀作用,引起空气细菌浓度的总体增加.相反,杭州是我国典型的南方旅游城市,城市的整体绿化率很高,一年四季植被的覆盖率都较高,整洁程度也较好,全年平均降雨量较高,空气的相对湿度较大,而且没有沙尘天气,这些都是引起空气细菌浓度降低的主要因素.对于空气真菌而言,首先杭州的气候条件(气温和湿度)非常适宜空气中真菌的生存和繁殖,其次杭州的植被覆盖率较高也是空气真菌浓度较高的主要原因,因为绿色植物的叶原基可以作为空气中真菌生长的天然培养基,导致空气中真菌浓度的增加.而北京的气候条件及绿色植物覆盖率问题都是其空气真菌浓度不高的关键因素[16-19,23-28].

杭州市不同样点空气细菌和真菌浓度百分比差异较大,BLQG空气细菌和真菌浓度百分比分别为21.0%和79.0%,YRBS则分别为41.1%和58.9%,这主要是由于样点之间较大的环境条件差异引起的.BLQG周边植物覆盖率很高,人流和车流相对较少,这会引起空气中细菌浓度及其百分比的降低,相反YRBS植被覆盖率较低,人流和车流较大,引起空气中细菌浓度及其百分比的增加.相对于真菌而言,植被覆盖率高能够引起空气中真菌浓度及百分比的增加.图5显示了杭州和北京室内外空气细菌和真菌浓度百分比的差异,从图中可以看出,北京室内空气细菌和真菌的浓度百分比分别为59.0%和35.2%,室外则分别为61.0%和39.0%,室内外空气细菌浓度百分比均显著高于空气真菌;而杭州室外空气细菌和真菌浓度百分比则分别为29.1%和70.9%,空气细菌浓度百分比显著低于空气真菌.杭州和北京空气细菌和真菌浓度百分比差异巨大,主要是我国南北方城市气候特征的巨大差异引起的[16-28].

杭州市不同取样点空气微生物总浓度显著不相同,ZJGSUJC的空气微生物总浓度最高为1413CFU/m3,其次为YRBS和BLQG,TJCR最低为834CFU/m3.这与我们以前北京的研究结果基本一致,在北京研究的3个样点中,文教区的空气微生物总浓度显著高于交通干线和公园绿地,这是因为文教区如ZJGSUJC的环境条件空气细菌和真菌浓度都较高,导致空气微生物总浓度相对较高,而交通干线如TJCR的环境条件空气真菌浓度较低,公园绿地如BLQG的环境条件空气细菌浓度较低,这就导致了空气微生物总浓度相对较低[16-19].此外,杭州市不同季节空气微生物总浓度显著不同,冬季空气微生物总浓度均显著低于其他季节,这可能是由于冬季气温较低,不适合空气中微生物的生长和繁殖[16-19].

在杭州市4个取样点优势空气细菌依次为微球菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、库克菌属和假单胞菌属,5属细菌约占55.26%~59.48%;优势空气真菌依次为青霉属,枝孢属、链格孢属、无孢菌和曲霉属,分别约占总数的29.49%、21.43%、10.98%、10.88%和7.74%.以上的研究结果与国内外其他城市或区域可培养空气微生物的研究结果基本一致[8-31].对于空气中的细菌而言,由于微球菌属等革兰氏阳性球菌所含有的胡萝卜色素等和芽孢杆菌的孢子,可抵御日光辐射的灭杀作用[31].但科研人员在研究森林、海岸、城市和乡村4个生态系统中空气细菌发现,芽孢杆菌是最为优势的菌属,微球菌属百分含量很低,葡萄球菌属则没有出现,这两个均为非优势菌属[32].这可能与取样环境密切相关,因为在干燥的环境条件下,那些能够忍受干燥环境的孢子能够萌发,而其它细菌粒子的活力就会比较差,这样能够显著增加空气中芽孢杆菌属的菌种百分比[32].对于空气中的真菌而言,研究发现北京市不同样点空气中枝孢属浓度百分比最高,均占36.0%以上,青霉属只占11.0%以上[33],而本研究杭州市不同样点青霉属和枝孢属浓度百分比平均值分别为29.5%和21.4%,南北方城市真菌群落结构差异较大,这可能与我国南北方城市的气候特征(如北方气候干燥降雨较少,南方气候湿润降雨较多)和植被条件(城市绿化植物种类及植被覆盖率等)密切相关.

4 结论

4.1 杭州市空气真菌浓度 (292CFU/m3)显著高于空气细菌 (848CFU/m3),空气细菌和真菌浓度分别占微生物总浓度的29.1%和70.9%.

4.2 杭州市空气微生物总浓度时空变化特征显著,ZJGSUJC空气微生物总浓度最高(1413CFU/ m3),其次为YRBS (1174CFU/m3)和BLQG (1137CFU/m3),TJCR最低(834CFU/m3),各个样点冬季空气微生物总浓度显著小于其他季节.

4.3 在4个样点分离的789株空气细菌中,革兰氏阳性菌和阴性菌分别占89.2%和10.8%,优势细菌属依次为微球菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、库克菌属和假单胞菌属,5属细菌总和约占55.26%~59.48%.

4.4 在4个样点分离纯化的352株空气真菌中,优势真菌属依次为青霉属,枝孢属、链格孢属、无孢菌和曲霉属,分别约占总数的29.49%、21.43%、10.98%、10.88%和7.74%.

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Characteristics of airborne microbes in typical tourist city in southeast China.

FANG Zhi-guo1*, HUANG Chuang1, LOU Xiu-qin2, LI Rui-zhe1, YAO Wen-chong1

(1.School of Environmental Science and Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310012, China；2.Microbiology Laboratory, Hangzhou Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310021, China)., 2017,37(8)：2840~2847

The characteristics of airborne microbes were carried out detailedly by culture-dependent method at four typical sampling sites in Hangzhou. Results showed that the concentration of total microbes, bacteria, and fungi ranged from 24 to 10135CFU/m3, 0to 3252CFU/m3, 0to 8767CFU/m3, respectively, and the mean concentration was 1140, 292, and 848CFU·m-3, respectively. In general, the concentration of airborne bacteria was significantly higher than that of airborne fungi, and the concentration percentage of airborne bacteria and fungi was 29.1 % and 70.9%, respectively. Significant difference of airborne microbes was observed at different sampling sites in Hangzhou, and the maximum concentration was found at ZJGSUJC (1413CFU/m3), followed by YRBS (1174CFU/m3) and BLQG (1137CFU/m3), with a minimum at TJCR (834CFU/m3). Amongst all the airborne bacteria,was the most dominant bacterial genus, followed by,,and, all of these five bacteria genera accounted for about 55.26% to 59.48% of total airborne bacteria. The predominant fungal genera were(29.49%),(21.43%),(10.98%), Mycelia sterilia (10.88%), and(7.74%), respectively. Results provide the first-hand information on airborne microbes in Hangzhou, and provide theoretical guidance for city management departments to develop relevant environmental policies and regulations, and also lay a foundation for the overall grasp of urban microbial characteristics in the air in China.

typical tourist city in southeast China；airborne microbe；bioaerosols；dominat bacteria and fungi；community characteristics

X513;X712

A

1000-6923(2017)08-2840-08

方治国(1977-),男,安徽黄山人,副教授,博士,主要从事空气生物性污染方面的研究.发表论文50余篇.

2016-12-16

中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室开放基金资助项目(SKLURE2015-2-1);浙江省自然科学基金资助项目(LY17D050006)

*责任作者, 副教授, zhgfang77@zjgsu.edu.cn