重组人血白蛋白工业应用研究进展

王宗太　马宁宁

[摘要]人血清白蛋白（HAS）在人血浆中的含量最为丰富，是蛋白质的一种，在血浆总蛋白中所占约60%的比重，生理功能不仅重要，而且较多，同时其也是制药工业中最为重要的一种原辅助料。当前市场中销售的HSA大部分为提取与人血浆，但是血液的隐藏风险较大，这就使得基因重组人血清蛋白（rHSA）成为HSA的首选替代品。本文重点介绍了重组人血清白蛋白在工业生产上应用的研究进展。

[关键词]重组白蛋白；细胞培养；药用辅料

[中图分类号] R977.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）07（a）-0011-04

The pharmaceutical application research progress of industrial production of Human serum albumin

WANG Zong-tai1，2 MA Ning-ning1

1.Shenyang Pharmaceat：cal University，Liaoning Province，Shenyang 110016，China；2.Biotechnology Branch of worth China Phanmacetice co，Lal，Hebei Province，Shijiazhoang 056215，China

[Abstract]Human serum albumin（HAS） is the most abundant in human plasma，is a protein，in the plasma total protein accounted for about 60% of the proportion of physiological function is not only important，but also more，but also the pharmaceutical industry The most important of a kind of raw auxiliary materials. Most of the HSA sold in the current market is extracted with human plasma，but the risk of blood is greater，which makes the recombinant human serum albumin（rHSA） a preferred alternative to HSA.The pharmaceutical application research progress of industrial production of rHSA were reviewed in this article.

[Key words]Recombinant albumin；Cell culture；Excipient

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的50%～60%[1]。HSA属于一种单链无糖基化蛋白质，组成为585个氨基酸，分子量是66.5 kD，等电点介于4.7～4.9。整个分子盘旋成心型，其三维结构如图1所示。

图1 人血清蛋白分子结构图

HAS具有广泛的临床应用和工业应用，国内主要生产厂家有成都蓉生、山东泰邦、华兰生物、四川远大蜀阳、山西康宝、上海生物制品研究所、上海莱士等。2015年国内批签发HAS约323吨，自2012年起连续四年增长率保持在10%以上，且由于血浆的短缺，进口产品约占58.7%，国内市场供应始终处于紧张状态。同时，HSA的市场售价相对较高，最高可达每克40元，进而导致我国各大医院的HSA储备量告急的情况，国家也不得不制定多种限制性较强的措施改善现状。这也间接导致了HSA的黑市高价交易等畸形销售现象。人们生活水平的额提升导致血液资源愈发紧张，HSA的紧缺情况也没有良好的改善，形势严峻。现阶段，临床及市场中大量应用的HSA的提取制备方法是低温乙醇法（Chon）与柱层析法[2-3]，被提取物为人类血浆。然而，人类血液中存在慢性乙肝、艾滋病等传染性疾病因子的可能性较大，且即使经过纯化工艺也难以保证不会将病毒带入产品中；另一方面血液供应也有限，特别是近年来生物医藥快速发展，人血白蛋白作为工业原辅料的需求量越来越大，使本来临床短缺的白蛋白更是雪上加霜，因此，寻找血液替代品迫在眉睫。

1 HAS的发展

1981年，Genentech公司的Lwan及另外几位员工首次对重组人血蛋白（rHSA）CDNA序列进行了专业性报道，并且第一次应用色氨酸（Trp）启动子。色氨酸引导源于质粒pBR322的TC一和AmP基因，其共同构造出全球首个rHSA表达载体Phsai，并取得了其在大肠埃希菌中的成功表达。30多年来，国际上许多实验室和公司都尝试通过遗传工程开发rHSA，且已经取得了突破性进展，国内外研究现状见表1。

华北制药经过十几年的技术研发，构建了稳定、高效分泌表达基因工程菌，拥有菌种构建、发酵、纯化等完整的自主知识产权，其中，纯化工艺专利在十三个国家获得授权。2011年建成符合cGMP生产线，产业化能力6吨/年，发酵单位达10 g/L以上，产率20%以上。相比由血浆提取HSA，采用基因重组技术生产rHSA，有明显优势：①严格按照生物制品标准，强大的工艺稳定性，很好的批次均一性；②纯度控制标准高于药典对HSA规定，纯度高达99%以上；③热原优势更明显，内控标准远高于国家药典对血源性HSA的规定；④具有血源HSA一致的氨基酸组成，有相同的理化特性；⑤无任何动物来源成份，远离血源性病毒污染，rHSA更安全；⑥原辅料没有制约，产量能满足市场供应。目前国内仅有华北制药具备了产业化条件，但是rHSA的工业应用尚处于前期，市场还在逐步培育，6吨/年产能还没有完全释放，按照目前的技术指标，满产后的成本相比HAS具有非常强的市场竞争力（图2）。

图2 工艺流程框图

华北制药研制的rHSA具有与血源白蛋白相同的结构、理化特性。近年来，有越来越多的关于rHSA非治疗作用的应用研究报道，如用于细胞培养促进剂、蛋白类药物稳定剂、药物和基因转运载体、化妆品添加剂等。

2作为培养基的重要组分促进细胞正常生长

rHSA在动物细胞及胚胎培养中的生理功能较多[4]，能够作为自由基清除剂、重金属螯合剂、稳定剂、表面活性剂以及营养物进行使用。它还可与维生素或激素等药物相结合，进而进入动物细胞中，提升细胞的生长速度，消除毒素以及蛋白酶等物质，减少其对细胞生长的不良影响。

2.1支持低密度CHO细胞生长

生命科学近年来发展迅速，哺乳动物细胞在生命科学中发挥着重要作用。动物源血清营养丰富，是细胞培养的良好培养基，但是动物源血清具有潜在的风险，是监管的难题。为证明rHSA联合化学成分确定的培养基能够支持低密度细胞的生长，Zhu等开展了细胞培养试验，结果表明在培养基中添加适当比例的rHSA，能有效支持低密度CHO细胞的生长[5]。

2.2对Vero、HKC细胞的促生长作用

在狂犬疫苗的生产过程中，无论是使用Vero细胞还是HKC细胞培养，在基础培养基中添加适当比例的HSA能够显著促进细胞生长，从而提高病毒表达。利用生物技术生产的rHSA与HSA具有相同的结构和理化特性，理论上应该对同等细胞的生长具有与HAS相同的促进作用。我们开展了大量的对比试验：针对Vero细胞[6]、HKC细胞等细胞，利用的培养基分别含相同比例的HAS和rHSA。试验结果证实，rHSA与HAS一样对Vero、HKC细胞有促生长作用。

2.3 rHSA在低温贮藏和细胞复苏方面的作用

生物制品生产过程中及细胞库中广泛利用冷冻技术进行种子细胞的保存。用rHSA以培养基组分的形式进行细胞冻存，其效果与胎牛血清的作用相似，相比市面上常见的冷冻剂，rHSA对细胞增长的维持以及存活作用更为理想。通过用rHSA替代胎牛血清进行低温贮藏和复苏的研究[7]，表明rHSA应用于细胞低温贮藏是可行的。

3作为辅料是蛋白或肽类药物的良好稳定剂

在实际药物以及生物制品的生产工作中，为提升其稳定性需添加一定量的稳定剂。HSA作为稳定剂现被广泛应用于当前市场销售的生物制剂中，其用量介于0.1%～0.2%。其被用作稳定剂的原因包括：①rHSA的稳定性良好，溶解性较为理想；②rHSA可以阻断蛋白质对容器壁的吸附。因此，rHSA在疫苗等制品中的应用率较高。血源HSA具有被污染的风险，也会因为其结构差异、生产批次不稳定等原因出现各种问题，因此，rHSA有望代替HSA作为药物稳定剂[8]。美国FDA将rHSA作为药用辅料已经收载入药典，默克公司利用rHSA为辅料的麻腮风三联疫苗已经获得美国FDA批准上市。

3.1抗氧化作用

rHSA具有一定的抗氧化作用，该作用的存在于其分析结构之间关系密切。rHSA中存在的大量点位均具有良好的抗氧化活性[9]。比如，rHSA中存在的自由半胱氨酸残基Cys-34是一种还原性巯基，对rHSA发挥抗氧化功能具有重要作用。rHSA中含有6个蛋氨酸残基，该物质上也有一定的巯基，对氧化作用具有高度敏感性，并在发生氧化作用后产生蛋氨酸亚砜残基。长链脂肪酸结合于rHSA中的Lys-351、Lys-475、Arg-117对脂肪酸有良好的保护作用，可减少自由基对其的攻击。同时，rHSA的Lys-240与胆红素相结合后，会对脂质过氧化进行良好抑制。

3.2增强药物的靶向性及安全性

增强药物的靶向性对药物有效性以及安全性的提升均有重要意义。HSA是抗肿瘤药物的主要载体，其具备载药量高、稳定性好、缓释靶向的特点[10]。2005年FDA批准APP公司的以HSA为载体的紫杉醇产品Abraxane上市， Abraxane具有胜过紫杉醇注射液的显著优点。rHSA也同样可以作为一种药物载体，通过不同的方式使药物的靶向性得到增强。一方面，药物可以制作成rHSA的纳米制剂，就可以减少药物的毒副作用，提高有效性。另一方面通过对rHSA加以修饰后，使其与靶蛋白结合配体以及药物相连接，促使药物实现靶向作用。

3.3药物传输系统中的载体

rHSA是人体血脑屏障运输载体，同时也转运非入侵性基因。一般来说，人体内的蛋白质以及肽类药物渗入血脑屏障的难度很大，但是嵌合肽的应用则能够将上述两类药物转运至血脑屏障内。无法进行转运的肽类药物能够和血脑药物的运载体共同形成一种嵌合肽[11]，而已经被阳离子化的rHSA中存在的氨基酸基團能够与多种化合物相结合。其与血脑屏障内皮中存在的多糖蛋白复合物产生静电作用，而阳离子化白蛋白-β-内啡嵌合肽就会借助介导细胞的转运作用进入大脑组织中。

3.4药物在体内半衰期被延长

HSA具有增加被结合蛋白分子质量，保护被结合蛋白的作用，当其与多肽类药物或者蛋白质结合后，会使其在人体内的半衰期有显著延长现象。糖尿病的临床治疗中，胰岛素是常用药物之一，但因其生物半衰期相对较短，因此需要增加用药频率以保证疗效。Dut-taroy等在研究中，将单链人胰岛素基因以及HSA二者相融合，最终获得半衰期较长的胰岛素，减少了给药频率[12]。另外，有研究中将马来酰亚胺衍生物与HSA相结合，进而获得半衰期较长的胰岛[13]。

4 rHSA的其他应用

4.1 rHSA突变体

临床中主要通过光线疗法对新生儿科黄疸疾病以及Ⅰ型Crigler-Najjar综合征予以治疗，而光线疗法结合重组白蛋白后再使用可快速有效的降低血清中尚未结合的胆红素水平。Crigler-Najjar综合征治疗的过程中，最为关键的治疗点在于维持胆红素浓度，一般在20.0 nmol/L左右。除此之外，还需要保证胆红素整体浓度不能超过HSA的整体结合水平[14-15]。当光线疗法与rHSA相结合应用时能够将胆红素进行溶解，使其成为无毒性异构体之一。有相关研究结果显示，改异构体的构成及构成速度和与rHSA结合的胆红素构象、电子环境关系紧密，因此产生的rHSA突变体能够在短时间内产生大量具有较强可溶性的胆红素光合物，其与野性HSA相比，在提升光线治疗效果中价值更高[16]。同时，rHSA突变体能够作为一种体外解毒剂作用在白蛋白透析中。

4.2 rHSA应用于化妆品领域中的分析

由于rHSA的特性，其在化妆品领域是被作为水溶性蛋白而应用的，是一种中性缓冲液，其生物兼容性十分良好，其应用于人体皮肤表面时，会在上面覆盖一层具有保护作用的薄膜，对去除皱纹、细纹具有良好的作用，同时还能够让使用者的皮肤变得更加透亮嫩滑[17]。在化妆品领域中，rHSA常以活性化合物被应用于各种化妆品中，相对来说，洗剂和霜剂中的rHSA含量较高，使用者通过洗剂和霜剂的应用来吸收rHSA，以此对肌肤进行调理。白蛋白纯化液对面部皮肤因老化而产生的鱼尾纹具有迅速的消除功效。在美国的一家化妆品公司，NEW CENTURY申请了一项专利，其主要内容为在该公司旗下的面霜、肥皂、洗发露等洗护产品中添加一定量的rHSA，使其在应用过程中能够吸附在使用者的皮肤以及头发表面，发挥其组织修复作用，快速修复使用者受损发质以及肌肤，同时rHSA作为活性成分具有减少过敏反应的作用[18]。例如，在洗发产品中添加适量的rHSA会减缓患者头皮发痒的感觉，消除头皮屑。而在国内专利中，一种具有保湿、防裂、改善皮肤粗糙暗沉的润肤霜中添加了甘草提取液、甘油成分以及rHSA后，使其上述功效得以最大发挥。

4.3在医疗器械方面的应用

rHSA与聚乙二醇（PEG）组成聚合物水凝胶已经成为医疗器械领域里的新成员，当这两种成分结合时，快速的交联反应产生水凝胶基质，具有强固的黏附性，这项技术让外科医生针对患者的胸腔手术，肺部漏气症状等可以进行更有效的手术。目前国内外许多公司正努力将此技术的应用平台扩展到脊柱、普通外科和妇产科等临床领域。国外Neomend公司应用诺维信生产的rHSA制造了应用于外科手术的密封胶ProGEL？誖LATINUM，已获得欧盟CE标识。自2010年4月起，该技术已在美国8000多病例中得到应用。

5展望

HSA是常用的临床药物，也广泛应用于生物药物的工业生产，可作为细胞培养基的重要组分、蛋白质类药物或肽类药物的稳定剂、药物传输系统中的载体等等。随着现代DNA重组技术、大规模培养和纯化技术的发展，国际、国内都实现了rHSA大规模产业化，且研究结果表明产品结构、性质与HAS无明显差异。rHSA作为临床用药、药用辅料、细胞培养基组分在国外都有广泛应用，国内的相关研究也都取得了实质性的进展。rHSA替代HAS具有广泛的社会意义，也是生物技术发展的必然趋势。

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（收稿日期：2017-05-21 本文编辑：崔建中）