冠心颗粒的标准研究

胡北　张朝绅　姜范成

[摘要] 目的 建立冠心颗粒的质量标准。 方法 采用薄层色谱法（TLC）对冠心颗粒中丹参、三七进行定性鉴别；采用2015年版《中国药典》微生物限度检查法进行验证试验，并对2批次样品进行微生物限度检查；采用高效液相色谱法对丹酚酸B进行含量测定：色谱柱为Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为以甲醇-乙腈-1%甲酸水溶液（29∶9∶62），流速为1.0 mL/min检测波长为286 nm。 结果 TLC鉴别斑点清晰、分离较好，阴性对照无干扰；2批冠心颗粒微生物计数方法适用性试验需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数各菌的回收率均在50%～200%，且均未检出大肠埃希菌，验证组可检出大肠埃希菌，该方法可行；丹酚酸B在0.06～0.54 mg/mL与峰面积呈良好的线性关系（r = 0.9998），平均加样回收率为98.61%，RSD = 1.24%（n = 6）；2批样品含量测定结果均符合要求。 结论 本方法所用定性、定量及微生物限度检查方法准确可靠、重现性好，能有效控制冠心颗粒的药品质量。

[关键词] 冠心颗粒；薄层色谱法；微生物限度检查；丹酚酸B；高效液相色谱法

[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（a）-0012-05

[Abstract] Objective To establish the quality standard of Guanxin Keli. Methods TLC method was used for the qualitative identification of Salvia miltiorrhiza Bge.， Panax notoginseng （Burk） F.H.Chen； the method validation was conducted by using microbial limit test in Chinese Pharmacopoeia 2015. 2 batches of Guanxin granules were tested under the validated method. HPLC was used to determine the content of salvianolic acid B. The determination was performed on KromasilC18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-1% formic acid water （29∶9∶62） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 286 nm. Results TLC spots were clear and well-separated without negative interference. The recoveries of each validation strain for the total aerobic micribial count， total yeasts and mold count were among 50%-200%， and did not test E. coli. This validation of method could test E. coli， and was capable. The linear range of salvianolic acid B was 0.06-0.54 mg/mL （r = 0.9998） with an average recovery of 98.61 %， RSD = 1.24% （n = 6）； the content of two batchs samples were satisfactory. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible. It is effective in controlling the quality of Guanxin Keli and providing the basis for improving the quality standas of Guanxin Keli.

[Key words] Guanxin Keli； TLC； Microbial limit test； Salvianolic acid B； HPLC

冠心顆粒是沈阳军区总医院（以下简称“我院”）自主研发的制剂，在我院已临床应用多年，由丹参、当归、川芎、三七、降香5味中药组成，此制剂用于治疗冠状动脉粥样硬化、供血不足导致的冠心病、心绞痛、心肌梗塞即中医的“胸痹”。本实验采用高效液相色谱法对丹参中丹酚酸B的含量进行检测，并采用薄层色谱法（TLC）对方中丹参、三七进行鉴别；参照2015年版《中国药典》微生物限度检查法进行微生物验证试验，建立了完善的冠心颗粒标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（DAD检测器）；岛津紫外-可见分光光度计（UV-1750）；AUW 120D型电子分析天平（岛津公司），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ3200）。

1.2 试药与试剂

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]和大肠埃希菌[CMCC（B）44102]均由中国食品药品检定研究院提供。

冠心颗粒（批号：20151101、20150809）及各阴性样品均由我院自制；丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111562-201313），丹参对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：120923-200610），三七皂苷R1对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110745-200312）；水为重蒸水（自制），甲醇和乙腈均为色谱纯（购自Fisher公司），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 丹参的薄层鉴别

取冠心颗粒1.3 g，研细，加10 mL水使其溶解，用稀盐酸将pH值调至2，加20 mL乙酸乙酯，进行萃取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加2 mL甲醇，作为供试品溶液。此外再取丹参对照药材0.5 g，加水30 mL，煎煮30 min[1-3]，滤过，同法制成对照药材溶液。按处方配比，取除丹参外的其他药材，制成颗粒剂，再按上述方法制得阴性样品溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取5 μL上述溶液，再各自点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮-甲酸（10∶4∶1.6）为展开剂[4-5]，展开，取出，晾干，置氨气熏蒸后，放置10 min，最后置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照不干扰丹参的鉴别（图1）。

2.1.2 三七的薄层鉴别

取冠心颗粒10 g，研细，加水50 mL使溶解，加入水饱和正丁醇30 mL，超声提取10 min，离心，取上清液，加3倍量以正丁醇饱和的水，摇匀，静置使其分层，分取正丁醇液[6-7]，蒸干，残渣加1 mL甲醇，作为供试品溶液。再取三七皂苷R1对照品，加甲醇制成1.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。按处方配比，取除三七外的其他药材，制成颗粒剂，再按上述方法制得阴性样品溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取10 μL上述溶液，各自点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22：10）10℃以下放置的下层溶液为展开剂[8-9]，展开，取出，晾干，然后用10%硫酸乙醇溶液进行显色，最后在105℃情况下加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照不干扰三七的鉴别（图2）。

2.2 微生物限度检查

2.2.1 菌液制备

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，制成需要浓度的菌悬液（用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行配置）；取黑曲霉的新鲜培养物，用3～5 mL含0.05%聚山梨酸酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。吸出孢子混悬液至无菌试管内，制成需要浓度的黑曲霉孢子悬液（用含0.05%聚山梨酸酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行配置）[10-12]。

2.2.2 供試液制备

取冠心颗粒10 g，加入100 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，振摇使其充分溶散，混匀，制成1∶10的供试液。

2.2.3 微生物计数法

2批次冠心颗粒的5株验证菌中，样品的回收率均在50%～200%的范围内，常规平皿倾注法适用于冠心颗粒的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数。

2.2.4 大肠埃希菌检查验证试验

取冠心颗粒10 g，加入100 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，振摇使其充分溶散，混匀，制成1∶10的供试液。

2.2.4.1 供试品组 取供试液10 mL，接种于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中。

2.2.4.2 阴性对照组 取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 mL，接种于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中。

2.2.4.3 阳性验证组 取供试液10 mL，接种于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，加入菌落数在10～100 cfu的大肠埃希菌菌悬液1 mL。

阴性对照组和供试品组均未见菌生长，阳性验证组麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，经分离、纯化和鉴定试验确证为大肠埃希菌。结果表明直接接种法可用于冠心颗粒大肠埃希菌检查。

2.2.5 微生物限度检查结果

2批冠心颗粒微生物限度检验结果表明：2批冠心颗粒需氧菌总数均小于103 cfu/g，霉菌和酵母菌总数均小于102 cfu/g；2批冠心颗粒均未检出大肠埃希菌。符合2015版《中国药典》微生物限度标准。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

用C18色谱柱；流动相：甲醇-乙腈-1%甲酸水溶液（29∶9∶62）[13-16]；以286 nm为检测波长。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于4000。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称定丹酚酸B对照品，用75%甲醇制成0.3 mg/mL的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

取本品，研细，取约5.0 g，放在具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 75%甲醇，密塞，称定其重量，超声30 min后，放冷，再称定其重量，用75%甲醇补足其减失的重量，摇匀，滤过，得供试品溶液[17-20]。

2.3.4 阴性对照溶液的制备

取按处方除去丹参的阴性样品5.0 g，按上述方法制备阴性对照溶液，即可。

2.3.5 专属性考察

分别精密吸取10 μL上述阴性对照溶液、供试品溶液、对照品溶液，注入高效液相色谱仪，测定结果见图3。

结果表明，丹酚酸B的保留时间约为13 min，阴性对照样品不干扰丹酚酸B的测定，丹酚酸B与其他成分或杂质的分离度大于1.5，理论板数按丹酚酸B峰计算均不低于4000。试验结果表明此法专属性强。

2.3.6 线性范围

精密吸取10 μL丹酚酸B对照品溶液，浓度分别为0.06、0.18、0.3、0.42、0.48、0.54 mg/mL，注入液相色谱仪，按“2.3.1”色谱条件进行分析，测定各自丹酚酸B的峰面积，以丹酚酸B对照品浓度（mg/mL）为横坐标，丹酚酸B峰面积值为纵坐标，求得线性回归方程：y = 12299 x-49.236，r = 0.9998。结果表明丹酚酸B在0.06～0.54 mg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.7 精密度试验

精密吸取10 μL对照品溶液，按“2.3.1”色谱条件分析，连续进样6次，记录丹酚酸B色谱峰的峰面积，测得其峰面积值的RSD为0.46%（n = 6），结果证明仪器精密度較好。

2.3.8 稳定性试验

取冠心颗粒约5.0 g，精密称定，按照“2.3.3”项下制备供试品溶液，按“2.3.1”色谱条件分析，分别在0、2、4、6、8、10 h，测定样品中丹酚酸B峰面积值，其RSD为1.73%（n = 6），结果表明冠心颗粒供试品溶液放置10 h稳定。

2.3.9 重复性试验

取冠心颗粒6份，每份约5.0 g，精密称定，按照“2.3.3”项制备供试品溶液，按“2.3.1”色谱条件分析，测定每份样品中丹酚酸B含量。结果6份样品中丹酚酸B平均含量为2.2982 mg/g，RSD为2.52%（n = 6），结果证明本方法重复性较好。

2.3.10 加样回收率试验

取冠心颗粒6份，每份约2.5 g，精密称定，分别加入6 mL丹酚酸B对照品溶液（浓度为1.0000 mg/mL），按照“2.3.3”项下制备供试品溶液，按“2.3.1”色谱条件分析，计算每份样品中丹酚酸B含量，求得回收率，结果表明，冠心颗粒中丹酚酸B的平均回收率为98.61%，RSD为1.24%（n = 6），符合要求。

2.3.11 样品含量测定

取2批冠心颗粒，按照上述方法制备供试品溶液，按“2.3.1”色谱条件项下色谱条件分析，测定每份样品中丹酚酸B的含量，结果见表1。

3 讨论

3.1 薄层鉴别

本实验对丹参薄层鉴别中提取溶剂乙酸乙酯、乙醚等溶剂进行考察，并对二氯甲烷-丙酮-甲酸、环已烷-乙酸乙酯等不同展开系统及不同比例进行比较，得到上述最佳薄层鉴别方法，使结果斑点清晰、阴性无干扰。

本实验对三七薄层鉴别中提取溶剂正丁醇、甲醇等溶剂进行考察，并对二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水等不同展开系统及不同比例进行比较，得到上述最佳薄层鉴别方法，使结果斑点清晰、阴性无干扰。

3.2 微生物限度检查

2015年版《中国药典》由于培养体系的变化，微生物限度方法将需要重新验证。本文的实验结果表明，2015年版《中国药典微生物限度检查》可以参照2010年版验证过的方法，采用类似的稀释步骤，建立满足2015年版《中国药典》需求的微生物限度检查方。2015年版《中国药典》方法在需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数上，检出率和检出数量都明显高于2010年版的细菌数、霉菌和酵母菌总数。

3.3 含量测定

本实验考察了超声和回流的提取方法，结果采用超声提取方法与加热回流提取方法的含量基本相同，但考虑到超声提取方法较为简便，故将提取方法定为超声提取。考察50%甲醇、75%甲醇、甲醇不同提取溶剂，结果表明：提取溶剂为75%甲醇时，测得的样品含量稍高于其他两种溶剂，故采用75%甲醇为提取溶剂。考察75%甲醇25、50、75 mL的溶剂用量，结果表明，溶剂用量为50 mL和70 mL时，测得的样品含量明显高于25 mL；溶剂用量为70 mL和50 mL时，测得的样品含量差别不大，故将提取溶剂用量定为50 mL。分别考察超声提取10、20、30 min，结果表明提取时间为30 min时测得的含量大于10 min和20 min，故将提取时间定为30 min。根据考察的结果确定下供试品溶液制备方法，此方法简便易行，且丹酚酸B含量较高，阴性无干扰，符合要求。

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（收稿日期：2017-03-08 本文编辑：苏 畅）