“焦三仙”炮制过程中5—羟甲基糠醛的含量变化研究

夏满琼　徐瑶　王玉霞

[摘要] 目的 探讨“焦三仙”炮制过程中5-羟甲基糠醛（5-HMF）的变化规律。 方法 分别于不同炮制时间炒制“焦三仙”样品，采用高效液相色谱法（HPLC）检测各样品中5-HMF含量。Agilent C18，色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-水（8∶92）为流动相，检测波长为283 nm。 结果 5-HMF在0.2～64.0 μg/mL范围内线性关系良好（r = 0.9997），平均回收率为99.74%，RSD值为1.37%。其中山楂、麦芽分别炒制8 min和6 min后5-HMF含量急剧升高，六神曲5-HMF含量则无明显变化。 结论 “焦三仙”在炮制过程中发生了美拉德反应，产生了共性成分5-HMF；山楂和麦芽5-HMF含量随炮制时间延长而增加，六神曲变化不明显。

[关键词] 焦三仙；美拉德反应；5-羟甲基糠醛；高效液相色谱法

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（a）-0008-05

[Abstract] Objective To investigate the change rule of 5-hydroxymethyl furfural （5-HMF） in the processing of "Jiao Sanxian". Methods The samples of "Jiao Sanxian" were fired with different processing time and the contents of 5-HMF in each sample were detected by high performance liquid chromatography （HPLC）. The HPLC analysis was performed on an Agilent C18， column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） and the mobile phase consisted acetonitrile-water （8∶92）， the detection wavelength was set at 283 nm. Results The linear range of 5-HMF was in the range of 0.2-64.0 μg/mL （r = 0.9997）， average recovery was 99.74%， and RSD was 1.37%. The contents of 5-HMF were increased remarkably at the 8 min and 6 min for Fructus Crataegi and Fructus Hordei Germinatus， respectively， while it showed a steady pattern for medicated leaven. Conclusion "Jiao Sanxian" has a Maillard reaction in the processing， which produces common element 5-HMF. The contents of 5-HMF in Fructus Crataegi and Fructus Hordei Germinatus are increased obviously with the extension of processing time， while it is not obvious for medicated leaven.

[Key words] Jiao Sanxian； Maillard reaction； 5-hydroxymethyl furfural； High performance liquid chromatography

中醫处方中常见到“一味”药——焦三仙，指的是焦山楂、焦麦芽及焦六神曲。这三味药用于消食化积时疗效突出，又因它们各具特色疗效，临床上常被合用并被冠以“焦三仙”的美名，意在用于消化的“仙药”。美拉德反应主要是指氨基酸、还原糖和蛋白质之间的复杂反应[1-2]。5-羟甲基糠醛（5-HMF）为糖的热降解产物，是美拉德反应的中间产物之一，现已成为中药炮制原理研究的热点之一[3-5]。目前，针对“焦三仙”炮制过程中美拉德反应多集中在炒制前后指标成分的变化[6-9]，而对其炮制过程中的共性成分变化报道较少。已有文献报道5-HMF为焦香气味的主要成分，具有一定的健脾作用[7]。本研究以5-HMF为指标，研究三味中药在炮制过程中的变化，为“焦香醒脾”理论提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 试药

生山楂、生麦芽饮片均购自四川北京同仁堂有限责任公司，批号分别为20150514、20150118；生六神曲饮片，购于四川弘升药业有限公司，批号20150212；5-HMF对照品购于成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-15051212，纯度≥98%，供含量测定用；甲醇，乙腈，HPLC级，美国Fisher公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

电子天平：艾德姆衡器（武汉）有限公司；LX-02利祥多功能粉碎机：上海江信科技有限公司；LC-20AT液相色谱仪，CBM-102色谱工作站：日本岛津公司。

2 方法与结果

2.1 “焦三仙”不同炮制品的制备

分别取200 g净山楂、净麦芽、净六神曲，参照《中国药典》（2015年版）四部炒法，控制火候为中火（380～450℃），分别炒至0、2、4、6、8、10、12 min，冷却，粉碎，过60目筛，备用。本研究以山楂为模型药物，建立5-HMF的含量测定方法并开展方法学研究。山楂炮制品分别编号为S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6。

2.2 “焦三仙”炮制过程中5-HMF的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取5-HMF对照品20 mg，置于100 mL量瓶中，制成每毫升含0.2 mg的溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取山楂样品S0～S6各0.5 g，加入40%甲醇溶液20 mL，超声40 min，冷却后补足质量，摇匀，过微孔滤膜，制成供试品溶液。

2.2.3 色谱条件 色谱柱Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相乙腈-水（8∶92），流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长283 nm，进样量10 μL。

2.2.4 线性关系考察 精密称取5-HMF对照品5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，作为标准曲线溶液。以峰面积为纵坐标（Y）、浓度为横坐标（X）绘制标准曲线（图1），标准曲线方程为：Y = 1.5650×105X-5431（r = 0.9997），5-HMF在0.2～64.0 μg/mL范围内线性关系良好（图2）。

2.2.5 精密度实验 精密吸取5-HMF对照品溶液10 μL，连续进样6次，分别测定峰面积，RSD值为1.37%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性实验 取供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24 h后进样，测定峰面积值，计算RSD值为0.64%，表明5-HMF对照品在24 h内检测稳定。

2.2.7 重复性实验 取山楂样品（S5）0.5 g，按“2.2.2”项条件制备供试品溶液，平行6份，按“2.2.3”项色谱条件测定，平均含量为0.81 mg/g，RSD值为0.65%（n = 6），表明本研究方法重复性良好（图3）。

2.2.8 加样回收实验 精密称取山楂样品（S5）6份，每份约0.25 g，分别加入5-HMF对照品溶液6.5 mL（C = 32 μg/mL），按“2.2.3”项色谱条件，进样测定，计算回收率，结果见表1。

2.2.9 “焦三仙”样品测定 按“2.2.3”色谱条件检测山楂、麦芽和六神曲各炮制品中5-HMF含量，结果显示，“焦三仙”中山楂、麦芽和六神曲在炮制过程中均产生5-HMF。其中，山楂中的5-HMF含量随时间变化较明显，随着炒制时间的延长，5-HMF含量呈上升趋势，炮制至8 min时出现“拐点”，并在10 min時达到最高值，随后又出现下降趋势。麦芽中的5-HMF含量在炮制6 min时开始明显上升，10 min后含量达到较高值，在12 min时达到最高值。六神曲中的5-HMF含量随着炮制的进行而缓慢增加，没有出现明显的“拐点”。见表2。

3 讨论

3.1 “焦三仙”炮制共性成分分析

通过测定发现，山楂、麦芽、六神曲在炮制前含少量或不含5-HMF，经过不同时间的炒制后，5-HMF含量逐渐增加，可见5-HMF为“焦三仙”炮制过程中的共性成分之一，可证明“焦三仙”在炮制过程中发生了美拉德反应。“焦三仙”在炮制过程中出现了焦香气味，并呈焦褐色，与美拉德反应最终产物类黑素，并伴有焦香气味基本一致。

3.2 “焦三仙”炮制过程中5-HMF含量对比分析

“焦三仙”炮制过程中产生的5-HMF含量不同，与美拉德反应发生所需的糖类和氨基酸有关。其中，山楂中含有较多糖类[10]和氨基酸，结果显示，山楂产生的5-HMF含量最高，与其所含葡萄糖和果糖关系最密切，果糖结构类型为呋喃型，较容易脱水合成5-HMF，而葡萄糖结构稳定，其结构中的氢键需在负离子作用下发生质子转移，使α-葡萄糖旋光异构成β-葡萄糖，再生成烯醇式化合物，从而使葡萄糖异构成果糖，再由果糖脱水生成5-HMF，故葡萄糖生成5-HMF较果糖复杂[11]。山楂在炮制10 min时含量达到最大值，可能是山楂中葡糖糖此时全部生成5-HMF有关，与刘苗苗等[12]报道的结果一致。

麦芽中也含有糖类[13]和少量氨基酸[14-15]，由于麦芽中糖类成分比较单一，与山楂相比，麦芽炮制后产生5-HMF含量较少，与已有文献报道一致[16]。六神曲中几乎不含糖类和氨基酸，美拉德反应程度较小，故六神曲炮制中产生的5-HMF含量较低。同时，美拉德反应会产生焦香气味，结果显示反应剧烈程度依次为山楂>麦芽>六神曲，而实际山楂炒制过程中所产生的焦香气味最浓烈，六神曲最微弱，与本研究结果一致。

3.3 山楂、麦芽5-HMF含量出现“拐点”原因分析

本研究中，山楂炒制0～8 min和麦芽炒制0～6 min过程中，5-HMF含量变化平缓，可推测此阶段为美拉德反应的第一阶段。随着炒制时间的延长，山楂炮制至8 min时，5-HMF含量出现“拐点”并急剧增加，可推测炒制8 min是美拉德反应的关键时间点，此时的温度、时间等条件有利于美拉德反应的快速发生，参与反应的还原糖和氨基酸大量消耗，5-HMF含量急剧增加，此阶段可能为美拉德反应的第二阶段，其反应产物以5-HMF为主，而10 min后可能为美拉德反应的第三阶段，此阶段反应产物以5-HMF为辅，故有所下降。同理，麦芽在生品时含有微量的5-HMF，表明麦芽在干燥过程中会发生美拉德反应，0～6 min为反应的第一阶段，炮制至6 min时出现拐点，5-HMF含量急剧增加，此阶段可能为美拉德反应的第二阶段。山楂、麦芽在炮制过程中5-HMF含量的这种变化与文献[17]报道的美拉德反应结果基本一致。

“焦三仙”作为临床常用中药，检测其炮制过程中5-HMF的含量变化，对探究“焦三仙”与美拉德反应之间的关系具有一定的参考意义。

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（收稿日期：2017-03-22 本文编辑：张瑜杰）