胃癌多药耐药细胞中FOXC1的表达及其意义＊

安艳新，孙力勇，王菁

胃癌多药耐药细胞中FOXC1的表达及其意义＊

安艳新，孙力勇，王菁＊

目的探讨FOXC1在胃癌耐药细胞中的表达情况及对胃癌细胞药物敏感性的影响。方法采用qRT-PCR、Western Blot法检测胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR、SGC7901/VCR及亲本细胞SGC7901中FOXC1的表达；应用siRNA下调胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR、SGC7901/VCR中FOXC1的表达后以MTT法检测上述细胞IC50值的变化。结果FOXC1在胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR、SGC7901/VCR表达显著高于亲本细胞SGC7901，当下调其表达后，SGC7901/ADR、SGC7901/VCR对多种化疗药物的敏感性显著升高。结论FOXC1参与胃癌多药耐药过程，但其相关分子机制有待进一步深入研究。

FOXC1；胃癌；多药耐药性

胃癌是危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，胃癌的全球病死率位居所有肿瘤第二位，仅次于肺癌［1］。目前，化疗是治疗进展期胃癌的主要手段之一，对于防治肿瘤的复发及转移具有重要的意义。然而耐药尤其是多药耐药性（multidrug resistance，MDR）的发生往往导致化疗失败，同时也是胃癌患者术后复发、远处转移直至病死的重要原因［2，3］。

FOXC1是叉头框转录因子基因家族（FOX）成员之一，其位于人染色体6p25基因编码区，具有FOX家族典型的螺旋翼状保守DNA结合区域［4］。近年来有研究发现，FOXC1在多种肿瘤中表达升高并且与肿瘤侵袭、TNM分期及预后密切相关［5-7］。然而有关FOXC1与胃癌尤其是胃癌耐药研究相对较少，前期研究中笔者初步发现FOXC1在胃癌多药耐药细胞中表达升高，该研究在前期基础上进一步研究FOXC1在胃癌多药耐药细胞中的表达情况，同时应用siRNA技术探讨FOXC1对胃癌细胞多药耐药性的影响。

1 资料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株胃癌细胞株SGC7901及多药耐药细胞株SGC7901/ADR、SGC7901/VCR来自西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室。应用RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清），按比例加入青链霉素，置于含5%CO2的孵箱中常规培养。

1.1.2 试剂RPMI-1640培养基及胎牛血清购自Gibco公司；TRIzol、LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒，Takara公司；PCR试剂盒购自广州复能基因生物有限公司；噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司；FOXC1单克隆抗体购自Abcam公司。

1.2 RNA提取及PCR检测Trizol法提取细胞总RNA后依照Takara反转录试剂盒相关说明进行，冰上操作。步骤：37℃，15min；85℃，5sec，4℃，重复。引物序列：上游5’－AGCATCCGCCACAC CTC－3’，下游5’－GCCTGTCCTTCTCCTCCTT－3’，β－actin作为内参均由Takara公司设计合成。取出RNA样品，依照复能基因逆转录试剂盒说明计算RNA需要量，采用三步法进行检测。

1.3 W estern blot检测提取细胞蛋白并定量。按说明配制12%SDS－PAGE凝胶。上样后以20mA恒流电泳。电泳结束后切取目的条带，准备滤纸和NC膜，于转膜仪中20 V恒压转膜20min。丽春红染色后标记分子量，剪取带有目的蛋白的NC膜置于5%脱脂牛奶中，室温封闭1 h。用2．5%脱脂牛奶按说明稀释一抗，最后置于4℃冰箱孵育过夜。TBST洗膜3次，5min/次，2．5%脱脂牛奶稀释二抗，室温孵育1 h。配制显影液，于BIO－RAD化学发光成像仪中显影。

1.4 siRNA设计、转染及检测FOXC1的siRNA及对照的设计和合成均由上海吉凯基因公司帮助完成。siRNA转染：取无菌Ep管，首先加入1ml OPTI－MEM培养基，然后加入20μl（5μl×4孔）Lipofectamine转染试剂，轻轻混匀，静置5min。再取4个Ep管，每管加入250μlOPTI－MEM培养基，然后分别加入siRNA1、2、3及对照，标记后室温静置5min。静置完成后每孔加入上述含转染试剂的OPTI－MEM培养基250μl，静置20min。去除6孔板内培养液，无菌PBS漂洗2次，每孔加入1．5ml OPTI－MEM培养基，最后将4个Ep管内混合液按上图加入相应孔内，4 h后换常规培养液，继续培养48 h。RNA提取及PCR检测，方法同上。

1.5 M TT法检测细胞药物敏感性变化将转染siRNA及相应对照的对数生长期细胞常规消化、计数，取8×103个细胞均匀铺于96孔板中，每组设3个复孔。24 h后将5－FU、VCR及CDDP等药物依照500μg/ml、250μg/ml、50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml及0．1μg/ml的浓度依次加入细胞中，常规培养48 h。培养结束后，每孔加入20μl避光保存的5mg/ml MTT溶液，孵箱中继续培养4 h。取出96孔板，小心吸净孔内液体，然后每孔加入150μl DEMO，于ZW－A微量振荡器上振荡10min，最后使用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的吸光光度值并计算IC50值。

1.6 统计学分析用SPSS 18．0统计学软件进行统计分析，数据以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXC1在胃癌多药耐药细胞中表达显著升高qRT－PCR和Western Blot结果均显示：与亲本细胞SGC7901相比，FOXC1在胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR、SGC7901/ADR中表达显著升高，两者表达水平差异具有统计学意义。见图1。

图1 FOXC1表达的PCR和W estern blot结果

2.2 siRNA可显著下调FOXC1在胃癌多药耐药细胞中的表达构建了3个针对FOXC1的siRNAs并验证转染效率。qRT－PCR结果如图2所示：针对FOXC1的3个siRNAs均可下调其在胃癌多药耐药细胞中的表达，其中第3个siRNA在两种耐药细胞中的干扰效果最佳，因此，后续的干扰实验均使用该siRNA完成。

图2 qRT-PCR验证siRNA的干扰效率

2.3 M TT实验证实下调FOXC1表达可显著增强胃癌多药耐药细胞化疗敏感性MTT实验结果如图3所示：与对照组相比，应用siRNA下调FOXC1表达后，两种胃癌多药耐药细胞对3种化疗药物5－Fu、VCR及CDDP的敏感性显著增强，表现为IC50值显著降低。

图3 下调FOXC1表达可显著耐药细胞化疗敏感性

3 讨论

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一。研究证实，术后接受化疗或术前先行新辅助化疗再进行手术是当前晚期胃癌病人最主要的治疗手段［8］。进一步研究还发现，与单一化疗药物相比，联合多种化疗药物治疗可显著提高胃癌患者的总生存期并有效改善晚期患者生活质量［9］。然而不幸的是，由于多药耐药的发生，最终导致化疗失败，甚至出现无药可医的局面［10］。尽管当前研究发现众多肿瘤耐药相关分子，但尚未能完全解释肿瘤多药耐药现象尤其在胃癌领域。因此，深入探讨胃癌多药耐药机制势在必行。

该课题组前期通过对胃癌多药耐药细胞进行高通量功能筛查，结果提示，FOXC1可能在胃癌多药耐药细胞中表达升高。既往研究发现，FOXC1在多种肿瘤的发生、发展过程中过程中发挥重要作用，广泛参与肿瘤增殖、凋亡及转移等多个生物学过程［4，7，11］，但有关耐药方面报道相对较少。该研究在前期基础之上，从RNA及蛋白两个层面对FOXC1进行验证，结果发现，与亲本细胞相比，FOXC1在胃癌多药耐药细胞中表达显著升高。那么其对胃癌耐药过程中是否具备功能呢？笔者接着设计了针对FOXC1的3个siRNA，PCR结果发现，第3个siRNA在两种耐药细胞中干扰效果最佳。而MTT实验结果证实，当下调FOXC1的表达后，胃癌多药耐药细胞对多种化疗药物的敏感性显著增加，以上结果与笔者前期实验结果也一致，在一定程度上，有理由相信FOXC1参与调节胃癌多药耐药。

综上，FOXC1在胃癌多药耐药过程中发挥重要调节作用，但其相关分子机制有待进一步研究。同时由于细胞试验无法完全模拟体内疾病环境，或者有更深层次的细胞生物学作用，这也是实验不足之处，下一步将在体外实验基础上开展动物实验并将FOXC1的表达情况与胃癌病人临床病理参数进行深入分析以明确FOXC1的调节作用。

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［2017－02－15收稿，2017－03－17修回］

［本文编辑：董冰媛］

The expression and significance of FOXC1 in multidrug-resistance cells of gastric cancer

AN Yan-xin①，SUN Li-yong，WANG Qing.
①Department of General Surgery，the General Hospital of Jinan Military Region，Jinan，Shandong 250031，China

Objective To investigate the expression of FOXC1 in multidrug-resistance cells of gastric cancer and its effect on chemosensitivity of gastric cancer cells.M ethods qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of FOXC1 in the cells of SGC7901/ADR，SGC7901/VCR and parent cells of SGC7901；the expression of FOXC1 in SGC7901/ADR and SGC7901/VCR was down-regulated by siRNA，the IC50 values of these cells were detected by MTT assay.Results The expression of FOXC1 in SGC7901/ADR and SGC7901/VCR was significantly higher than that in SGC7901.After the expression of FOXC1 was down-regulated，the sensitivity of SGC7901/ADR and SGC7901/VCR to various chemotherapeutic drugs was significantly increased.Conclusion FOXC1 is involved in multidrug-resistance process of gastric cancer，but its molecular mechanism remains to be further studied.

FOXC1；Gastric cancer；Multidrug resistance

R735.2：R979.1

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.08.006

国家自然科学基金（81602615）

250031山东济南，原济南军区总医院普外科（安艳新，孙力勇），口腔科（王菁）

王菁，Email：wangjing1121@126.com