乳酸菌发酵羊乳制备抗氧化肽的研究

杨丽娜，葛武鹏，万金敏，王智，袁亚娟，耿炜，李小鹏，吴小勇

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100；2.陕西百跃优利士乳业有限公司，陕西咸阳712000；3.咸阳质量技术检测检验所，陕西咸阳712000；4.咸阳市食品药品检测检验中心，陕西咸阳712000）

乳酸菌发酵羊乳制备抗氧化肽的研究

杨丽娜1，葛武鹏1，万金敏1，王智2，袁亚娟3，耿炜3，李小鹏4，吴小勇4

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100；2.陕西百跃优利士乳业有限公司，陕西咸阳712000；3.咸阳质量技术检测检验所，陕西咸阳712000；4.咸阳市食品药品检测检验中心，陕西咸阳712000）

为研究羊乳发酵后乳清提取物的抗氧化能力，采用乳酸菌对其进行发酵。从发酵菌株的筛选到发酵条件的优化以及发酵产物的初步分离做了研究。以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）及羟基自由基（·OH）清除率为指标，通过乳酸菌的筛选与复配，优化发酵工艺条件，并利用膜技术分离其抗氧化组分。结果表明：①确定了最佳发酵条件，在此条件下发酵羊乳乳清提取物对DPPH、·OH清除率分别为70.30%和88.42%，较未发酵前分别提高了64.63%和27.20%。②比较羊乳发酵前后提取物的不同分子量组分的抗氧化活性，结果表明，分子量小于6 ku组分其抗氧化活性高且羊乳发酵后抗氧化活性明显提高。

羊乳；乳清；乳酸菌；抗氧化肽；抗氧化活性

0 引言

活性氧(ROS)和自由基是具有一个或多个未成对电子的高活性的分子，可以直接攻击DNA、RNA、蛋白质和其他生物大分子[1]。证据表明，含有抗氧化活性的食物可以清除ROS和自由基，帮助预防一些疾病[2]。乳酸菌细胞内有一套较完整的降解蛋白质的酶体系，并为益生菌[3]。Kullisaar等[2]研究发现发酵能提高山羊乳抗氧化活性；Nandhini等[4]发现，乳酸菌发酵的山羊乳有较强的自由基清除和抑制脂质过氧化能力。目前，国内外一般采用酶解法从牛乳或乳蛋白中制备抗氧化肽，发酵羊乳中的抗氧化肽的研究国内鲜见报道。本研究主要探讨优选乳酸菌与传统发酵剂嗜热乳酸菌优化复配发酵羊乳乳清提取物的抗氧化活性。以新鲜脱脂羊乳为基料，优选复配乳酸菌菌株，优化发酵条件，发酵后分析评价其乳清提取物的抗氧化活性，为乳酸菌发酵羊乳制备抗氧化多肽提供参考。

1 实验

1.1 材料与试剂

鲜山羊乳：采自西北农林科技大学畜牧养殖厂。

乳酸菌株：本实验室优选并经过安全性评价的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP）LPGY-L086和LPGY-L089，以及类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lb.paracasei ssp.paraca⁃sei,LC)LCGY-L003和LCGY-L004；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus,ST)。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析纯）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DRP-9162生化培养箱；SW-CJ-2D双人单面超净台；HC-3018R高速低温冷冻离心机；紫外可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 发酵剂的制备

将乳酸菌菌株活化，在灭菌脱脂乳培养基（115℃，20 min）连续传代3次后，接入37～42℃静止培养6 h。

1.3.2 实验方案

首先通过水解度和抗氧化活性筛选出优良的乳酸菌;接着分别就接菌量、发酵温度、发酵时间和菌株复配比等进行单因素试验确定其相应水平值。并在单因素基础上进行正交实验L9(43)，确定最佳发酵工艺条件。对最优条件的发酵产物进行超滤处理，对分离的不同分子量的组分进行抗氧化活性比较。

1.3.3 pH值的测定

参照GB/T 12456-2008。

1.3.4 发酵羊乳中乳清提取物的制备

为了找出发酵对抗氧化活性的影响，把发酵好的羊乳样品，调节pH值到等电点，离心(5 000 g，20 min）除去其中未水解酪蛋白，上清液过0.45 μm的滤膜，得到的滤液氮气处理后储存在-20℃备用。未发酵羊乳做同上处理做为对照。

1.3.5 蛋白水解度（DH）的测定

用凯氏定氮法测定脱脂羊乳中蛋白的含量；用OPA法测定样品的水解度[5]：取2 mL发酵样品加入1 mL的蒸馏水后使其彻底混合，然后与5 mL质量浓度为120 g/L的三氯乙酸(TCA)混合在一起，静止反应10 min，混合物在3 000 g离心10 min，得上层清液备用。用质量浓度为0.1 g/L的丝氨酸（Serine）做标准溶液。分别取400 μL的预处理好的样品、标准溶液和去离子水与3 mL的OPA试剂混匀，精确反应2 min后在340 nm出测其吸光值（OD）。

1.3.6 抗氧化活性的测定

（1）DPPH清除能力测定。参考shabboo[6]的方法，准确吸取1 mL，0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液与适量浓度的样品充分混合，在室温下避光反应30 min，于517 nm处测定样品的吸光度。

（2）·OH的清除能力[7]。取少量的待测样品加入1.8 mL的蒸馏水中混匀，分别加入2 mL，6 mmol/L FeSO4，2 mL浓度为6 mmol/L的H2O2混合后静置10 min，然后加入2 mL浓度为6 mmol/L水杨酸混匀，避光反应30 min。在510 nm处测吸光值，记录为Am。用双蒸水代替水杨酸再次测其吸光值，记录为An，空白对照组以双蒸水代替样品，测其吸光值，记录为Ap。羟基自由基的清除率为

式中：Ap为对照组吸光值；Am为样品组吸光值；An为空白组吸光值。

（3）螯合Fe2+的能力。测定螯合Fe2+的能力参考Li Yun等[8]的方法，取适量的样品用去离子水稀释至3.7 mL，加入0.1 mL浓度为2 mmol/L的FeCl2，反应3 min后加入0.2 mL浓度为5 mmol/L的菲洛嗪抑制此反应。混匀此混合溶液后在室温下放置10 min，在562 nm在测其吸光值。空白对照是用去离子水替代样品。

螯合能力计算公式为

式中：As为样品的吸光值；Ac为空白对照的吸光值。

（4）还原能力测定。采用铁氰化钾法测定[9]。取1 mL样品溶液于试管中，然后加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)2.5 mL和1%的铁氰化钾溶液2.5mL。混合物在50℃水浴中反应20 min，迅速冷却并加入10%TCA 2.5 mL，混匀后以3 000 rpm离心10 min，离心后取2.5 mL上清液加入0.1%FeCl3溶液0.5 mL并混匀，再加2.5 mL蒸馏水并混合均匀，以蒸馏水为空白对照管，在700 nm处测定吸光度。样品的吸光值越高，说明样品的还原能力越强。

1.4 羊乳发酵前后抗氧化组分的初步分离

将羊乳、发酵羊乳制备的乳清提取物，用标准分子量6 ku的超滤膜进行超滤处理，得到大于和小于6 ku两个组分，冷冻干燥后保存备用。

1.5 统计分析

结果以均值±标准差（x±SD）表示。采用Minit⁃ab16.2.3进行统计数据分析，采用Origin8.0作图。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

2.1.1 单菌培养对羊乳发酵产物抗氧化活性影响

将LPGY-L086，LPGY-L089，LCGY-L003和LCGY-L004分别接入已灭菌的脱脂羊乳中，接种量5%，37℃培养，在发酵0，4，8，12，20，24，28，32，36，48 h取样15 mL；4℃环境下放置24 h后，测其pH值、水解度和抗氧化活性；抗氧化活性以DPPH和·OH自由基清除率为指标。同时以未发酵脱脂羊乳做空白对照，结果如图1所示。

图1 测定用乳酸菌发酵脱脂羊乳过程中pH值，DH，DPPH及·OH清除的变化

由图1可以看出，由于乳酸菌前期快速增长，产酸能力强，pH值先迅速下将到4.5后趋于平稳。DH随发酵时间的增加，呈现上升趋势，这是因为在发酵过程中，羊乳蛋白被乳酸菌产生的胞外蛋白酶水解，从而形成多肽片段。同时乳清提取物的DPPH和·OH清除率基本呈现先增加后下降的趋势，在24 h左右达到最大值，且DPPH清除率与·OH清除率之间存在相关性，LPGY-L086（r=0.962），LPGY-L089（r=0.863）高度相关；LCGY-L003（r=0.650），LCGY-L004（r=0.638）中度相关。随着时间延长自由基清除率有所下降的原因是一部分具有抗氧化活性的肽被蛋白酶水解。LPGY-L086和LPGY-L089比其他两株菌具有较高的DH及自由基清除能力。LCGY-L003发酵后的羊乳DH和自由基清除率与其他乳酸菌相比处于中间。LCGY-L004发酵的羊乳的DH及自由基清除率都低。因此，单一菌株发酵时2株LP为最好。

2.1.2 菌株复配培养对羊乳发酵产物抗氧化活性影响

有研究表明，乳酸杆菌和嗜热链球菌之间存在共生作用，混合培养将促进两者更好地生长，在蛋白质水解过程中存在良好的协同作用[10]。将2株LP分别与传统发酵剂ST以1∶1接入已灭菌的脱脂的羊乳中，接种量5%，37℃培养24 h后，测其pH值、水解度和抗氧化活性，同时与羊乳对照，如表1所示。

表1 菌株复配培养后产物pH值、DH、DPPH和·OH清除率比较

由表1可以看出，与未发酵羊乳相比，发酵后的羊乳乳清提取物的DH、DPPH及·OH清除率都有一定程度的提高；菌株复配培养后的DH、DPPH及·OH清除率明显提高。与单菌培养相比，混合培养后自由基清除率的效果并非都好，比如：LPGY-L089与ST混合后DPPH清除率有所提高，但·OH清除率变化不大。造成这种现象可能的因为菌株的相互作用使发酵产物里抗氧化组分种类及含量不同引起的。综合比较以LPGY-L086与ST进行混合发酵为优，可以作为发酵羊乳的菌种。

2.2 从羊乳中制备抗氧化肽发酵条件的优化

2.2.1 接菌量对发酵产物自由基清除率的影响

图2 接菌量对自由基清除率的影响

本研究固定菌种比为1∶1，发酵温度为37℃，发酵时间24 h，研究随着接种量的不断提高发酵乳清提取物对DPPH及·OH清除率的变化。如图2所示，当接种量在4%时产物对DPPH及·OH自由基清除率较高，此后随着接种量的增加自由基清除率增加缓慢，从自由基清除率及发酵成本考虑选定4%的接菌量。

2.2.2 发酵温度对发酵产物自由基清除率的影响

固定接种量4%，发酵时间24 h，菌种比1∶1，研究产物对DPPH及·OH清除率随温度的变化情况，结果如图3所示。

图3 发酵温度对自由基清除率的影响

由图3可以看出，随着发酵温度的增加，发酵乳清提取物的DPPH及·OH清除率先增大后减小，在37℃达到最大。这是因为培养温度影响乳酸菌的生长和混合生长菌株的比例，从而影响着代谢产物的形成[9]。

2.2.3 发酵时间对发酵产物自由基清除率的影响

由图4可以看出，发酵时间为20 h和24 h时，产物对DPPH及·OH清除率呈上升趋势，当超过24 h，产物对DPPH及·OH清除率呈下降趋势，因此选择发酵时间为24 h。

2.2.4 菌株复配比对发酵产物自由基清除率的影响

固定接种量4%，发酵温度37℃，发酵时间24 h，研究产物对DPPH及·OH清除率随菌株复配比的变化情况，由图5所示，当菌株复配比(LPGY-L086∶ST)为1∶1时DPPH及·OH清除率达到最大值，分别为56.71%和78.52%。

2.2.5 正交实验

在筛选乳酸菌菌种基础上，选取接种量、发酵温度、发酵时间和菌株复配比(LPGY-L086∶ST)4个因素，通过L9(43)正交表进行优化实验，以期得到最佳的发酵培养条件。实验设计及正交实验结果如表2所示。

图4 发酵时间对自由基清除率的影响

图5 菌株复配比对自由基清除率的影响

由表2中极差分析的结果显示，发酵接菌量是影响发酵产物自由基清除率的主要因素，菌株复配比对其产生的影响相对最小。各因素的影响程度从大到小依次为A＞C＞B＞D。所以，对于发酵羊乳清提取物清除DPPH及·OH而言，最优的发酵水平组合为A1B3C2D1，即接种量为3%，发酵温度为42℃，发酵时间为24 h，菌株复配比(LPGY-L086∶ST)为2∶1。该条件下的发酵乳清提取物产物对DPPH和·OH清除率分别为70.30%和88.42%。发酵乳清提取物对DPPH和·OH清除率分别为70.30%和88.42%，较羊乳乳清提取物分别提高了64.63%和27.20%。

表2 L9（43）正交实验方案与结果

表3 膜分离后各组分的抗氧化活性

2.3 超滤分离后各组分的抗氧化活性

用标准分子量为6 ku的超滤膜将羊乳乳清提取物进行超滤处理，依次按分子量大小分离为2个组分：组分FA（分子量＜6 ku）、组分FB（分子量＞6 ku）。收集分离的组分进行冷冻干燥，再配制成一定浓度，测其抗氧化活性。同时与同等浓度的VC作对照，如表3所示。

由表3可以看出，在同等浓度时，VC对DPPH及·OH清除率和还原能力最大，螯合Fe2+能力均小于羊乳和发酵羊乳乳清提取物分离组分FA；羊乳和发酵羊乳乳清提取物的组分FA对DPPH及·OH清除率、螯合Fe2+能力及还原能力均显著大于组分FB，且发酵羊乳乳清提取物的组分FA的抗氧化活性大于羊乳乳清提取物的组分FA。因此羊乳中抗氧化组分主要集中在分子质量6 ku以下，这同前人的研究结果一致[11-13]。

3 结论

（1)从4株乳酸菌中优选出2株植物乳杆菌，分别于传统发酵剂ST复配后，LPGY-L086与ST的发酵产物与单菌培养相比，DPPH及·OH清除率明显提高。本研究选取LPGY-L086和ST作为羊乳发酵培养的菌株。

（2)从羊乳中制备抗氧肽的最佳发酵工艺条件：菌株复配比（LPGY-L086∶ST）为2∶1，接种量为3%，发酵温度为42℃，发酵时间为24 h。发酵产物的DPPH清除率为70.30%，·OH清除率为88.42%，较羊乳分别提高了64.63%和27.20%。

（3)对羊乳和发酵羊乳乳清提取物进行超滤分离，比较分离出的不同分子量组分的抗氧化活性表明：羊乳和发酵羊乳乳清提取物中分子量小于6 ku组分其抗氧化活性高；且发酵后乳清提取物中分子量小于6 ku的抗氧化活性明显高于发酵前，即发酵羊乳乳清提取物中抗氧化组分分子质量在6 ku以下。

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Study on antioxidant activity of peptides in fermented goat milk with Lactic acid bacteria

YANG Lina1，GE Wupeng1，WAN Jinmin1，WANG Zhi2，YUAN Yajuan3，GENG Wei3，
LI Xiaopeng4，WU Xiaoyong4
(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Shanxi Baiyue You lishi Dairy Co.,LTD,Xian 710000,China;3.Institution of Inspection of Xianyang Bureau of Quality and Supervi⁃sion,Xianyang 712000,China;4.Xianyang Food and Drug Inspection Center,Xianyang 712000,China)

The fermented products of the goat milk was prepared by Lactic acid bacteria for studying on the antioxidant capability.This article mainly from the fermentation strain screening to the optimization of fermentation conditions and fermentation product preliminary separation to do the research.The scavenging rate of 1,1-dipheny l-2-trinitrobenzene hydrazine(DPPH)and hydroxyl radicals(·OH)was used to evaluate the antioxidant capacity.By Lactic acid bacteria screening and distribution,optimization of fermentation conditions,and the antioxi⁃dant components were separated by membrane separation technology.The results showing that:①Under the optimum condition of the goat milk whey fermentation extracts on DPPH,·OH clearance respectively 70.30%and 88.42%,increased by 64.63%and 27.20%respectively than before fermentation.②It showing that,by comparing the antioxidant activities of component with different molecular weights isolated from extract from whey of before and after fermented,it is the component with less than 6 ku molecular weight that has higher antioxidant activity and goat milk antioxidant activity increased significantly after fermented,that is,the molecular weight of antioxidant peptide in goat milk fermented is less than 6 ku.

goat milk;whey;Lactic acid bacteria;antioxidant peptides;antioxidant activity

Q939.11+7

：A

：1001-2230（2017）07-0004-05

2016-11-30

陕西省科技厅战略性新兴产业重大产品（群）项目(2015KTC Q03-08)及(2016KTZDNY02-04)。

杨丽娜(1992-)，女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

葛武鹏