4株引起馒头腐败变质细菌的分离和鉴定

何钦1，李星陆2，周瑾1

（西北师范大学附属中学，兰州一中）

4株引起馒头腐败变质细菌的分离和鉴定

何钦1，李星陆2，周瑾1

（西北师范大学附属中学，兰州一中）

围绕生物课程“神奇的微生物”、“生态系统”和“食品保存”等内容展开，以现实生活中变质馒头为研究对象，通过探究引起变质的原因，进而认识微生态环境下生长的奇妙微生物群落。以变质馒头表面微生物为研究对象，采用富集培养、选择性培养基培养和画线分离等技术手段对其进行了分离纯化，并对分离菌株的菌落形态、显微形态、生理生化特征进行了分析，结果表明，从变质馒头表面共分离获得4株细菌，综合微生物特征和生理生化特性结果判定N1、N2和N3属于芽孢杆菌，N4属于荚膜菌。

随着人们对微生物[1]认识的不断深入，微生物已被广泛应用于食品生产中。微生物在食品工业生产中既有利又有害，有利的方面如酵母菌可制面包、酒；霉菌可制豆酱、酱油；乳酸菌可制泡菜、酸奶等[2]；有害的方面主要表现在会使食品变质，如制面包时，若不用高温充分烘烤，其中的芽孢杆菌就会大量繁殖使面包变味；制泡菜时，若温度过高，丁酶菌迅速生长繁殖会带来腐臭等异味。本文就日常生活中的变质馒头表面微生物为研究对象，采用富集培养、选择性培养基培养和画线分离等技术手段对其进行了分离纯化，并对分离菌株的菌落形态、显微形态、生理生化特征进行了分析。

1 、材料与方法

1.1 实验材料

材料：霉变的馒头

试剂：重铬酸钾、琼脂、甘露醇、酵母粉、琼脂粉、磷酸氢二钾等购自烟台双双化工试剂厂，均为分析纯。牛肉膏蛋白胨培养基；柠檬酸盐培养基，以上培养基参照沈萍编著的《微生物试验指导》进行配制。

主要仪器：超净工作台、数码成像显微镜（MOTIC）等。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的收集

轻轻地将变质馒头表皮撕下来，浸泡在50mL无菌水中，制成菌悬液，备用。

1.2.2 微生物的富集培养

在超净工作台中无菌状态下，从菌悬液中分别吸取1.0 mL至50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃下振荡培养16～24h。

1.2.3 微生物的分离和纯化

分别取出经富集培养的微生物菌悬液，采用画线分离法分别在细菌分离固体培养基上画线分离，培养。如此反复几次，观察微生物菌落形态，将认为是纯种的微生物进行菌株保藏。

1.2.4 菌株形态学及生理生化鉴定

参照细菌鉴定手册进行菌落形态观察和生理生化实验鉴定。

2 、结果与讨论

2.1 变质馒头细菌的分离、纯化和生理特性

2.1.1 变质馒头细菌的菌落形态

对变质馒头进行细菌的分离和纯化，按照微生物生长菌落形态差异，获得4株具有一定生长差异的细菌，分别命名为N1，N2，N3和N4。菌落形态如图1，各菌落形态描述结果如表1，从图1和表1中可以看出不同细菌生长速度有所差异，菌落大小各异，其中N3生长速度最快，N2最慢；菌落都是圆形，除了N4外其他菌株边缘光滑；N1表面干燥。

编号 N 1 N 2 N 3 N 4细菌

图1 变质馒头中分离获得细菌菌落形态结果

表1 4株细菌菌落形态描述结果

2.1.2 变质馒头细菌的显微形态特征

根据细菌的显微鉴定和观察方法，分别采用革兰氏染色和芽孢染色对分离的4株菌株进行染色，制片，结果如图2。在10×40放大倍数的光学显微镜下4种细菌中N1、N2、N3显微结果中既有芽孢也有营养体，而且芽孢呈绿色，营养体呈红色，进一步说明三株菌产芽孢，N4不产芽孢，N1、N2为革兰氏阳性菌，N3、N4为革兰氏阴性菌， N1、N2、N3和N4的细胞形态为杆状。

图2 4株菌株芽孢染色和革兰氏染色结果光学显微镜观察结果（×40）

2.1.3 变质馒头细菌的生理生化特性

分别对4株细菌进行了V.P.试验、M.R.试验和柠檬酸盐试验。结果显示，除N3菌甲基红试验结果为阳性外，N1、N2、N4都为阴性，并且4株菌的伏-普试验都为阳性。由此说明，N4不能利用葡萄糖，N1、N2和N3都能发酵利用葡萄糖，产生丙酮酸，由于糖代谢的途径不同，可能会产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。进一步通过V.P.试验说明，四株菌株在糖代谢过程中，可以分解葡萄糖产生丙酮酸，进而丙酮酸通过缩合和脱羧生成3-羟基丁酮，被还原成2,3-丁二醇，3-羟基丁酮在碱性条件下，可被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与培养基里蛋白胨中的胍基作用，生成红色化合物，由此表现为阳性。4株菌的柠檬酸盐试验结果表现为阴性。由此说明N1和N3菌株能以柠檬酸钠为碳源，并分解柠檬酸盐产生碳酸盐，使培养基变为碱性，培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。

2.1.4 引起馒头变质细菌的主要菌群

通过对变质馒头细菌的分离纯化、菌落形态和显微形态特征的观察并结合生理生化试验，各试验反应现象如表2，对照细菌鉴定手册初步确定变质馒头表面细菌主要为芽孢杆菌和荚膜菌，N1、N2和N3属于芽孢杆菌，N4属于荚膜菌。

表2 4株细菌的生理生化结果

3 、结论

通过对变质馒头表面细菌进行了分离、纯化、生理生化试验鉴定，初步确定了本研究中放置于冰箱中的变质馒头表面滋生的4株细菌主要是芽孢杆菌和荚膜菌。

[1]刘正雄，等.中华小百科全书·生物卷，四川: 四川教育出版社，1994

[2]蔡信之，等.微生物学.上海:上海科学技术出版社，1996