铁皮石斛种子在“组织培养技术”实验拓展中的应用

谢婷婷 李小雪 王 静 陈 洁 陈炳华

(福建师范大学生命科学学院 福州 350117)

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)，是兰科石斛属多年生附生草本植物，亦是一种传统的中药材，全株可供药用，具有抗肿瘤、抗衰老和提高人体免疫力等功效[1]。铁皮石斛广泛分布于浙江、福建、安徽、广西和云南等省，自然生长于岩石或树干上。近些年来，由于人类的过度采集和生境的破坏，铁皮石斛的野生种群急剧减少。为满足市场需求，科研人员利用植物组织培养技术开展了铁皮石斛产业化的生产，成功地培养出种苗，移栽至大棚[1]，进而规模化地栽植于梨(Pyrus×michauxii)、杉木(Cunninghamialanceolata)和木荷(Schimasuperba)等植株树干上，带来经济效益的同时，解决了铁皮石斛野生资源匮乏的难题。目前，铁皮石斛种苗的产业化采用“种子非共生性萌发”的方法，依据的原理是其单个蒴果中种子数量极多、体积小且无胚乳，在无菌的培养基及人工培养条件下，种子萌发率高。

目前，中学生做植物组织培养实验往往由于污染问题影响了实验的成功，其中外植体污染是重点难题之一[2]。在人教版生物学(选修1)《生物技术实践》的专题3“植物的组织培养技术”中，采用的材料为新鲜的外植体。由于外植体长期暴露于空气中，本身带有一些菌，加之外植体的结构较不规整，影响了彻底消毒。众所周知，在组培实验过程中，愈伤组织的形成是该实验成功的关键一步，但在实践操作中，往往因为消毒过度直接导致外植体的死亡，或者因消毒不充分，将外源菌带入培养基中，造成培养基的污染，进而影响了愈伤组织的形成，最终造成实验失败或结果不理想的多。这些将在一定程度上挫伤学生对该实验的积极性，同时难以实现教学目标，导致学生对植物组织培养技术的感性认识缺失。

为此，如果能提供一种自然条件下无菌或少菌的胚(相当于已消毒适当的外植体)为材料，让学生开展“植物组织培养技术”实验，实验成就感和自信心则大大地提升。笔者认为，铁皮石斛的种子是该实验专题拓展设计的好材料，尤其适合于南方地区的学校开展教学。

1 实验材料的选取

铁皮石斛采自人工种植的苗圃，系自然结实的蒴果。铁皮石斛果实呈纺锤形，成熟时果皮由绿转浅黄色，长约2.4 cm，重不足1 g(表1)。采用“差减法与粘取计数法”相结合[3]的方法对蒴果内种子进行科学计数，结果见表1。

表1 铁皮石斛的蒴果和种子数

表1表明，成熟的铁皮石斛蒴果中含有近15万粒的种子。种子数目之多，可为组织培养教学提供大量的材料。自然条件下，果实成熟后果皮开裂，种子随风飘落在树干或岩石上传种接代。但铁皮石斛的种子需要经过特定的真菌感染后才能萌发，因此自然萌发率极低。显微镜下，种子呈纺锤形且不规则，中间膨大的部分有一个呈鲜黄色的胚，其余部分为种皮，种皮的一端较细尖，另一端较宽钝(见图1-A)。只有在外源能量(人工培养基)合适的条件下，种子才能萌发，并发育成苗。

为此，选取蒴果中的种子作为外植体是可取的。这完全有别于其他有胚乳种子的播种发芽。

2 外植体的消毒

在蒴果内未开裂前，成熟的铁皮石斛种子表面无菌。因此，外植体消毒就只要对蒴果果皮进行消毒即可。

具体流程如下：选择成熟未开裂的蒴果，先用流水冲洗干净，在超净工作台内将清洗完毕的蒴果置于体积分数为75%乙醇中浸泡3 min，并振荡，接着用无菌水冲洗2～3次后；再用75%乙醇(考虑到升汞溶液本身有毒，在中学阶段学生不宜接触且在实验室其废液不好处理等原因[4])处理5 min，用无菌水冲洗5次。

3 原球茎的分化

将已消毒的蒴果置于无菌滤纸上，用解剖刀(事先高压灭菌过)切开蒴果果皮，然后用镊子将果壳夹住，在培养瓶瓶口轻轻抖动，边抖边转动培养瓶，使种子均匀地洒在MS培养基表面。为使种子均匀分布，可事先在培养瓶中滴加3～5滴的无菌水。一个蒴果可接种5～10瓶。培养条件[1]：光照强度1500～2000 Lx，温度为(26±2)℃，光照时间为12 h/d。培养4 d的情况，如图1-B。种子在培养5 d后逐渐由黄变绿，10 d后胚发育明显(图1-C)。随着胚进一步膨胀，绿色逐渐加深，其形状近似椭球体，胚的两端呈不对称，一端较另一端有突起出现，部分种皮逐渐消失。椭球体以原球茎途径进行生长，在原球茎顶端突起一小绿点，后逐渐纵向伸长，形成叶原基并逐渐增大长成第一片幼叶(图1-D)。

4 生根培养

培养41 d后，将形成的原球茎转接至含10%香蕉汁和0.1g/L活性炭的MS培养基进行生根培养。培养条件与原球茎的分化一致。

原球茎的底部颜色逐渐变浅，呈现为乳白色渐渐分化为白色的根，继续培养，最终发育成幼苗(图1-E和图1-F)。

图1 铁皮石斛种子及非共生性萌发结果

5 讨论

结实率高、其蒴果内种子数量多，这是铁皮石斛种子作为“组织培养技术”专题教学供选拓展材料的前提。在实际的教学中，采用铁皮石斛的种子作为实验材料具有取材方便，经济等优点。此外，在未开裂的铁皮石斛蒴果中，其种子始终处于封闭环境中，是洁净无菌的[5]。

因此，采用铁皮石斛种子作为“组织培养技术”专题教学的拓展材料，能有效避免因消毒不当而导致实验结果不理想的结果，有利于增强学生对该实验的信心及积极性，促进学生感性知识的获取，从而内化形成理性认识。

所以，将铁皮石斛作为南方地区中学开展“组织培养技术”专题教学的拓展材料是合适的。