诺如病毒分析检测方法

高光普

诺如病毒感染性腹泻是在全世界范围内的流行疾病，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发状态。诺如病毒感染性强，近些年国内外也爆发过多次由诺如病毒引起的病毒感染事件。为了让大家更好地了解诺如病毒，北京良润生物科技有限公司总经理刘磊老师来到了食安大讲堂，向观众分享了他多年来从事诺如病毒研究的相关认知。

诺如病毒感染事件

近年来，国内爆发了多次诺如病毒感染事件：2010年12月，广州从化有429人发病，调查后最终确认是由水污染引起的诺如病毒感染；2013年4月，揭阳市某学院有近400人患感染性腹泻，经当地疾控中心化验判断，主要是诺如病毒傳播引起的；2014年2月，嘉兴市有400多名学生感染就医，累计报告发病人数511人；2014年12月，广州越秀区某小学21人发病，波及217人；2015年1月深圳有140名发病，经检测已确定引发此症状的原因系诺如病毒；2016年3月，北京市卫计委公布数据显示，2016年1～2月，北京市报告了31起急性胃肠炎聚集性疫情，其中有28起是由诺如病毒引发。以上每次事件波及的人数众多，对我国人民的生命财产安全造成了很大损失。

诺如病毒检测方法

诺如病毒（Norovirus，NoV），又称诺瓦克病毒，是一组形态类似、抗原略有不同的病毒颗粒。可感染人或动物，引发急性肠胃炎、冬季呕吐性疾病、胃肠性流感等病症，主要临床表现为头痛、发热、恶心、腹痛腹泻等，是非细菌性胃肠炎的主要病原体之一。随着检测技术的不断进步，对于诺如病毒的检测也出现了越来越多的方法，其中代表性的方法有电镜法、免疫法、RT-PCR 3种（对比见表1）。

诺如病毒最初是通过电镜检测发现的，因此最初的诺如病毒诊断方法主要是电镜法（EM）与免疫电镜法（IEM）。通过电镜观察病毒粒子的形态来确认诺如病毒，需要的病毒浓度较高，因此灵敏度与特异性相对较低，并且只能够在比较专业的检测机构才能进行，无法普及。

随着人们对诺如病毒研究的不断深入，免疫法逐渐被用来检测诺如病毒。免疫法主要有放射免疫法（RIA）、生物素-亲和素免疫法（Biotin- Avidin Immunoassy）以及酶联免疫法（ELISA）。RIA的灵敏度要比IEM高10～100倍，但需要使用放射元素进行标记，且时间较长（6d）；BiotinAvidin Immunoassy是美国疾病预防控制中心基于RIA建立的简化方法，灵敏度与RIA相近；ELISA具有灵敏度高、耗时少、经济的优点，便于广泛推广，但株型特异性太强，应用范围较狭窄。

随着分子生物学的飞速发展，市场上出现了更加灵敏、特异、快速的核酸检测方法，包括等温核酸扩增（NASBA）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光染料RT-PCR、荧光探针RT-PCR、多重RT-PCR等。RT-PCR方法是目前检测诺如病毒应用最广泛的方法，被称为检测诺如病毒的“金标准”。NASBA直接扩增RNA来进行检测，仪器相对简便，通过琼脂糖凝胶电泳、印迹杂交或者荧光检测来鉴定结果，灵敏度低于RT-PCR；RTPCR通过逆转录RNA模板、PCR扩增特异性产物，使用琼脂糖凝胶电泳来鉴定结果；荧光染料RT-PCR通过向RT-PCR反应体系中添加非特异性的荧光染料，可以在反应过程中监测扩增产物的生成量，但需要做熔解曲线分析来确定反应的特异性；荧光探针RT-PCR通过特异性的荧光探针与引物，可实时监控反应过程中特异性产物的变化，并且可以实现同一管中多个基因的检测（多重），特异性较好，假阳性率低，检测灵敏度可达10～100拷贝/反应，可用于取代普通RT-PCR。