瘦素对局灶性脑缺血后内质网应激相关蛋白的作用☆

胡诗俊彭定天谭静梁志坚阳礼程道宾

·论 著·

瘦素对局灶性脑缺血后内质网应激相关蛋白的作用☆

胡诗俊*彭定天*谭静*梁志坚*阳礼*程道宾*

目的探讨瘦素对大鼠局灶性脑缺血后内质网应激相关蛋白的影响。方法SD大鼠40只，随机分为假手术组、脑缺血组、脑缺血瘦素预处理组，线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型，在闭塞血管前3 h皮下注射瘦素，于闭塞血管6 h后采用Longa 5分制量表进行神经功能评分、称量体重及脑水肿变化，并灌注取脑，采用免疫荧光化学法检测内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78（glucoseregulated protein 78,GRP78）及C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）表达。结果脑缺血瘦素预处理组和脑缺血组体重变化未见差异（P＞0.05）；脑缺血瘦素预处理组神经功能评分（1.90±0.31 vs.2.50±0.52,P＜0.05）和脑水肿程度（3.60±0.52 vs.7.70±0.94,P＜0.001）明显轻于脑缺血组，同时脑缺血瘦素预处理组GRP78表达明显高于脑缺血组（48.69±5.06 vs.35.78±4.35,P＜0.01），CHOP表达明显低于脑缺血组（38.81±5.34 vs.60.24±4.11,P＜0.01）。结论瘦素可减少神经功能缺损并可能与其上调GRP78蛋白，下调CHOP蛋白来减弱脑缺血导致的内质网应激有关。

瘦素 局灶性脑缺血 内质网应激 葡萄糖调节蛋白78 C/EBP同源蛋白

近年来，有多篇文献报道瘦素可作为缺血性脑血管病的一个潜在的治疗药物，为脑卒中的治疗提供了另一种可能的选择[1-3]。GRP78和CHOP是内质网应激的两个经典标志蛋白,目前认为GRP78表达上调对细胞起保护作用，而CHOP表达上调则启动细胞凋亡途径[4]。本实验通过构建MCAO模型探讨瘦素对脑缺血内质网应激标志蛋白GRP78和CHOP表达的影响，以进一步研究瘦素的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备成年雄性SD大鼠由我校实验动物中心提供，所有实验步骤经广西医科大学医学伦理委员会批准并在实验过程中并严格遵守相关规程。实验大鼠在实验开始之前12 h开始禁食,可以随意饮水。

本实验MCAO模型采用线栓法[5]制作。假手术组采用同样的手术操作但不插入线栓。手术过程在有保温垫的动物手术操作台上进行，维持SD大鼠肛温在（37.0±0.5）℃。

1.2 动物分组40只雄性SD大鼠（250 g～280 g）按随机分配原则随机分配至3个实验组，分别为脑缺血瘦素预处理组（n=15）：皮下注射瘦素（1 mg/kg）（美国PeproTech公司）的MCAO模型SD大鼠（n= 15）；脑缺血组：皮下注射生理盐水（1 mg/kg）的MCAO模型SD大鼠；假手术组（n=10）：皮下注射生理盐水（1 mg/kg）的假手术组SD大鼠。所有分组药物注射时间为实验前3 h。

1.3 神经功能评分参考LONGA[5]的5分制法在术后6 h进行神经功能评定：0分为无神经损伤症状。1分为轻度局灶性神经功能缺失（瘫痪侧前/后肢不能完全伸展）；2分为中度局灶性神经功能缺失（向瘫痪侧转圈）；3分为重度神经功能缺失（爬行时向瘫痪侧倾倒）；4分为不能自发行走，意识丧失。排除标准：术后死亡大鼠；蛛网膜下腔出血、大脑中动脉起始部或其附近的willis环动脉有凝血块的大鼠；栓线插入深度不足18 mm，且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠。

1.4 脑水肿和体重评估在MCAO手术开始前和大脑中动脉闭塞6 h后分别测定大鼠体质量，体质量变化的数据表现为：术前体重-闭塞6 h体质量。在闭塞大脑中动脉6 h的后，将大鼠深麻醉并快速取出大脑，并立即将大脑分为左、右半球，剔除小脑和脑干。将分离出的两侧大脑半球在精密电子天平上称量。脑水肿程度的数据表现为：脑水肿=受损的同侧半球体质量-对侧半球质量[6]。

1.5 组织切片标本制备各组大鼠在脑缺血6 h后腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）深麻醉,沿剑突下打开胸腔，从心尖处向主动脉弓插管，并剪开右心耳，先用无菌生理盐水约500 mL灌注冲洗至流出生理盐水颜色澄清，换用4%的多聚甲醛500 mL灌注至全身僵硬，取脑置于4%的多聚甲醛液中，4℃固定24 h，常规脱水蜡块包埋后经组织切片机（德国Leica公司）在前囟位置（既脑梗死部位）做冠状连续切片，片厚2～5 μm，脑片置于-20℃冰箱保存。

1.6 免疫荧光染色石蜡切片标本经0.5%Triton孵育、山羊血清封闭后，滴加适当稀释的一抗：GRP78抗体（稀释浓度约为1：150）（英国Abcam公司），CHOP抗体 （稀释浓度为1：100） （英国Abcam公司），4℃过夜，PBS浸洗 3次后滴加FITC标记荧光二抗 （稀释浓度为1：250） （美国santa cruz公司），避光孵育1 h后PBS浸洗3次，DAPI复染胞核（中国Solarbio公司），室温保湿避光孵育15 min。PBS浸洗3次，取适量缓冲甘油封片。对照试验用PBS代替一抗。荧光显微镜下观察免疫反应荧光强度。后期图像分析采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）。每只大鼠标本取5张切片，每个切片随机抽取4个视野后计算并且进行统计。

1.7 图片采集图像采集采用OLYMPUS BX53荧光显微镜,对免疫荧光组织切片进行采集，400×倍光镜观察各组免疫荧光反应强度，并采集图像。

1.8 统计学方法采用SPSS 17.0进行统计分析。结果描述为（±s）。神经功能缺陷评分采用Mann-Whitney U分析。两组间计量资料比较采用两组独立样本t检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析和LSD检验。检验水准α＝0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 神经功能缺陷由于假手术组并没有出现神经功能缺陷，所以没有对假手术组进行比较。在遭受大脑局灶缺血6 h后，脑缺血瘦素预处理组和脑缺血组都出现不同程度的神经功能缺陷。结果表明脑缺血瘦素预处理组的神经功能缺陷评分显著低于脑缺血组 （P＜0.05），说明瘦素可改善急性脑卒中引起的神经功能缺陷（表1）。

2.2 脑水肿程度由于假手术组并没有闭塞血管造成脑组织损伤，未观察到脑组织水肿，所以没有对假手术组进行比较。在遭受大脑局灶缺血6 h后，脑缺血瘦素预处理组和脑缺血组都出现不同程度的脑水肿。结果表明脑缺血瘦素预处理组的脑水肿程度低于脑缺血组的水肿程度，差异有统计学意义 （P＜0.001），说明瘦素可改善脑水肿程度（表1）。

2.3 体质量变化结果表明各实验组体质量都出现不同程度变化。其中，脑缺血瘦素预处理组的体质量与脑缺血组体质量相比，并差异无统计学意义（P＞0.05），说明瘦素并不会影响缺血6 h内的体质量变化；而假手术组体重，相对于其他实验组，体重变化呈现出差异具有统计学意义 （P＜0.001）（表1）。实验过程未观察到实验大鼠死亡。

2.4 大鼠脑缺血区GRP78和CHOP免疫荧光组化表达结果表明各实验组中都存在GRP78蛋白的表达。假手术组中可见少量GRP78表达。在遭受大脑局灶缺血6 h后，脑缺血组的GRP78蛋白表达较假手术组出现一定程度的升高 （P＜0.01）。而脑缺血瘦素预处理组的GRP78蛋白表达明显高于脑缺血组（P＜0.01）(见图1、表2）。CHOP在假手术组中几乎未见表达，而在脑缺血组中出现明显的表达（P＜0.001）。但同样是遭受6 h大脑局灶缺血，脑缺血瘦素预处理组的CHOP表达量远低于脑缺血组（P＜0.001）（见图2、表2）。

3 讨论

我们的研究发现，瘦素并不会加重脑卒中后的体质量变化，但可减少神经功能缺陷，并减少脑水肿程度，这与相关文献报道的结果相一致[6-7]。瘦素的一个重要生理作用是调节体质量[8]，在大鼠皮下注射剂量为1 mg/kg的瘦素并不会加重脑卒中后引起的体重消耗性降低，说明瘦素可能在此剂量下即可起到神经保护的作用同时又具有相对的生物安全性。

表1 各组体质量变化、脑水肿程度、神经功能缺陷评分结果（±s）

表1 各组体质量变化、脑水肿程度、神经功能缺陷评分结果（±s）

1）与假手术组比较，P＜0.001；2)与脑缺血组比较，P＜0.001；3）与脑缺血组比较，P＜0.05

组别假手术组脑缺血组脑缺血瘦素预处理组n 10 15 15体质量变化(g) 4.52±0.56 8.65±0.891)8.58±0.521)脑水肿程度(mg) / 7.70±0.94 3.60±0.522)神经功能缺陷评分/ 2.50±0.52 1.90±0.313)

表2 大鼠缺血皮层GRP78及CHOP蛋白荧光密度

缺血性脑卒中导致的脑组织缺氧会引起的内质网应激会进一步损伤神经细胞。GRP78是一种位于内质网的分子伴侣，在正常组织中可见少量表达，可作为一种保护性因子以避免内质网应激导致的细胞凋亡坏死[9]。而CHOP是一种重要的内质网应激相关促凋亡蛋白，在正常细胞中几乎未见表达，但在内质网应激时可大量表达，诱导细胞凋亡[10]。而在脑缺血后6 h后即可观察到GRR78和CHOP表达显著增多[11]，这与本研究结果基本一致。此外，本研究通过目的蛋白和DAPI双重荧光标记发现GRR78表达多集中于细胞质，在细胞核未见有明显的表达；而CHOP蛋白的表达似乎并没有明显的分布差异，在细胞核内也可见有CHOP蛋白表达，其原因可能是CHOP也参与了细胞核转录的作用[12]。本研究结果提示瘦素可促进GRP78蛋白的表达，抑制CHOP蛋白的产生。一方面，GRP78作为一种内质网应激保护性蛋白，其表达的增多说明瘦素可在一定程度上保护神经细胞免受内质网应激损害。另一方面，CHOP表达减少也间接说明瘦素减弱了在缺血区域的内质网应激。这表明瘦素的脑保护作用可能与瘦素对内质网应激相关蛋白的影响有关。

图1 大鼠缺血皮层GRP78+DAPI荧光标记图。A为假手术组，B为脑缺血组，C为脑缺血瘦素预处理组，比例尺为20μm

已有研究表明在大鼠持续性大脑中动脉闭塞（permanent middle cerebral artery occlusion）模型条件下，在闭塞血管3 h皮下注射瘦素可起到最大程度的神经保护作用，而在此动物模型条件下在闭塞血管后立即注射瘦素并不会起到明显的神经保护作用[7]。其原因可能是在闭塞血管后注射瘦素可能无法使瘦素有效通过血脑屏障并达到有效的药物浓度。

本研究表明瘦素可改善局灶性脑缺血引起神经功能缺陷并减少脑水肿程度。同时，瘦素可通过促进GRP78蛋白表达，下调CHOP蛋白表达缓解大鼠局灶性脑缺血导致的内质网应激，说明减弱内质网应激作用可能是瘦素神经保护作用的一个重要组成部分，为阐明瘦素治疗脑缺血提供了新的理论依据和治疗思路，但与之相关的具体信号传导通路仍有待进一步研究。

图2 大鼠缺血皮层CHOP+DAPI荧光标记图。A为假手术组，B为脑缺血组，C为脑缺血瘦素预处理组，比例尺为20μm

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Effects of leptin on endoplasmic reticulum stress related proteins after focal cerebral ischemia.

HU Shijun,PENG Dingtian,TAN Jing,LIANG Zhijian,YANG Li,CHENG Daobin.Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,22 Shuangyong Road,Nanning 530021,Guangxi,China.Tel:0771-5356735.

ObjectiveTo investigate the effect of leptin on endoplasmic reticulum stress related protein after focal cerebral ischemia in rats.MethodsIschemia was induced by occluding the middle cerebral artery in rats brain using the filament occlusion method.Forty SD rats were randomly divided into sham operation group,cerebral ischemia group and leptin-preconditioning group.Leptin was injected subcutaneously before occlusion of blood vessel.Longa 5 score neurological function scale,body weight and brain edema changes were measured 6 hours after MCAO, and the brain was removed to detect the endoplasmic reticulum marker protein:glucose-regulated protein 78(GRP78) and C/EBP-homologous protein (CHOP)by immunohistochemical method.ResultsThere was no difference in the body weight changes between leptin-preconditioning group and ischemic group.In the leptin-preconditioning group, the neurological function score (1.90±0.31 vs.2.50±0.52,P＜0.05)and the degree of brain edema (3.60±0.52 vs.7.70±0.94,P＜0.001)were significantly lower than those in the cerebral ischemia group.Moreover,the expression of GRP78 in leptin-preconditioning group was significantly higher than that in ischemia group (48.69±5.06 vs.35.78± 4.35,P＜0.01),and the expression of CHOP was significantly lower than that of ischemia group (60.24±4.11 vs.38.81±5.34,P＜0.01).ConclusionLeptin can reduce the neurological deficit and may be associated with the up-reg-ulation of GRP78 protein,and down regulation of CHOP protein to weaken the endoplasmic reticulum stress caused by cerebral ischemia

Leptin Focal cerebral ischemia Endoplasmic reticulum stress GRP78 CHOP

R743.3

A

2016-11-12）

（责任编辑：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.06.006