太湖流域中华鳖不同群体线粒体基因序列比较分析

韩晓磊，顾 益，徐棉棉，沙永良，徐建荣，韩曜平

（1.常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500；2.太仓市西湖川水产专业合作社，江苏 太仓 215400）

太湖流域中华鳖不同群体线粒体基因序列比较分析

韩晓磊1，顾 益2，徐棉棉1，沙永良2，徐建荣1，韩曜平1

（1.常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500；2.太仓市西湖川水产专业合作社，江苏 太仓 215400）

通过PCR扩增和测序技术对太湖流域的中华鳖太湖花鳖群体和太湖鳖群体的部分线粒体基因序列，包括16S rRNA、12S rRNA、细胞色素b（Cytb）和D-loop区进行比对分析研究. 结果显示：中华鳖太湖花鳖群体和太湖鳖群体的16S rRNA、12S rRNA、Cytb和D-loop区部分基因序列比对相似度和遗传距离分别为97.33%，98.19%，97.34%，98.83%和0.023，0.026，0.026，0.022.结果表明：中华鳖太湖花鳖群体和太湖鳖群体亲缘关系较近，没有达到种间差异，但两者已经出现了一定程度的遗传分化，达到亚种分化水平.

中华鳖；16S rRNA；12S rRNA；细胞色素b；D-loop区

线粒体DNA是共价闭合的双链DNA分子，核酸组成和序列较保守，基因排列的顺序稳定而紧密，无单拷贝和重组. 由于线粒体DNA含有丰富的进化信息，具有长度短、含量丰富、母性遗传和进化速度快等特点，已成为研究动物遗传分化及起源进化的理想手段［1-5］. 中华鳖（Pelodiscus sinensis），隶属于爬行纲（Reptilia）、龟鳖目（Testudoformes）、鳖科（Trionychidae），俗称甲鱼、团鱼、王八等. 在我国，中华鳖分布广泛，除西藏和青海外的其他各省均有发现，长江流域和华南地区分布较多，太湖流域产量历年稳居全国前列［6-7］. 中华鳖太湖群体除普通中华鳖群体，即太湖鳖群体之外，还存在中华鳖地方特色品种，即太湖花鳖群体，其主要生活在长江中下游，特别是太湖流域，因其背上有对称的黑色小圆花点，野生环境中身体油绿，裙边宽厚，腹部有灰黑色块状花斑，故此得名. 太湖花鳖较之太湖鳖具有野性足、生长快、色泽艳、肉质好等特点，并因其独特的风味和较高的营养价值深受消费者喜爱，江浙地区养殖广泛，市场前景良好.目前研究显示，中华鳖还没有明确的亚种分类，但却存在着一些不同的地理群体，其中太湖花鳖的分类地位也没有明确论断［8］. 本文利用线粒体DNA测序技术对太湖流域中华鳖太湖花鳖群体和太湖鳖群体进行遗传多样性分析，以判断两个群体是否有遗传分化，为太湖流域中华鳖不同群体间的种质鉴定和分类地位提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 实验材料

中华鳖两个群体样品采集在2014年5—10月间，太湖花鳖群体取自太湖流域太仓地区（野生群体，图1（a），太湖鳖群体取自太湖流域常州地区（野生群体，图1（b）.取中华鳖腿部肌肉组织为材料于无水乙醇中-20 ℃保存备用，太湖花鳖群体和太湖鳖群体分别取30尾和19尾进行实验，各群体将每个个体DNA进行混合作为模板，以用于该群体的线粒体DNA序列分析.

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取

中华鳖基因组DNA的提取参照韩晓磊等［9］的方法. 用分光光度计（Thermo Scientific NanoDrop 2000）测定基因组DNA浓度，并通过琼脂糖电泳检测DNA的完整性，置-20 ℃保存备用.

1.2.2 引物设计

图1 太湖流域2个中华鳖群体形态示意图

根据GenBank上中华鳖线粒体基因组序列（AY687385.1）分别设计用于扩增16S rRNA、12S rRNA、Cytb和D-loop区基因的6组引物（见表1），送苏州金唯智生物科技有限公司进行合成，用去离子双蒸水将其溶解至浓度为10 μM.

1.2.3 PCR扩增

PCR扩增反应体积为25 μL，含模板基因组DNA100 ng，10×Buffer 2.5 μL，MgCl（22.5 mol/L）2.0 μL，dNTP 1.5 μL，上下游引物各1 μL，1U Taq DNA聚合酶，加无菌水补足. PCR反应的循环参数为：94 ℃预变性2 min；94%变性45 s，55.3 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min.将PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化后送至苏州金唯智生物科技有限公司直接进行序列测定，为保证序列的准确性，序列经过正反两次重复测定.

1.2.4 序列比较和分析

所获得的序列删除引物序列再经校对后，应用DNAMAN 7.0软件与GenBank下载的序列进行序列排序并比对，生成供系统发生分析的矩阵. 利用MEGA 5.1软件进行序列分析，得出碱基组成、遗传相似度、遗传距离、变异位点和转换/颠换值等.

表1 中华鳖线粒体DNA扩增引物及序列

2 结果与分析

2.1 16SrRNA基因序列分析

中华鳖太湖花鳖群体和太湖鳖群体的16S rRNA扩增产物大小分别为1676 bp和1680 bp，两个群体的16S rRNA相似度为97.33%，遗传距离为0.023；经序列比对，两序列共有35处碱基的差异，其中转换18个，颠换6个，核苷酸的替换位点主要以转换为主，碱基转换与颠换比为3.0，表现出较高的转换偏倚（见表2）；太湖花鳖群体16S rRNA碱基的缺失位点为5处，而太湖鳖群体为2处；太湖花鳖群体16S rRNA未测定的碱基数为3个，而太湖鳖群体为15个.

表2 太湖鳖群体和太湖花鳖群体不同基因序列分析

2.2 12S rRNA基因序列分析

中华鳖太湖花鳖群体和太湖鳖群体的12S rRNA扩增产物大小分别为901 bp和900 bp，两个群体的12S rRNA相似度为98.19%，遗传距离为0.026；经序列比对，太湖花鳖群体和太湖鳖群体共有16处碱基的差异，其中转换12个，颠换3个，核苷酸的替换位点主要以转换为主，碱基转换与颠换比为4.0，表现出较高的转换偏倚（见表2）；太湖花鳖群体12S rRNA碱基的缺失位点为1处，而太湖鳖群体为0处.

2.3 Cytb基因序列分析

中华鳖太湖花鳖群体和太湖鳖群体Cytb的扩增产物大小分别为1201 bp和1200 bp，两个群体的Cytb相似度为97.34%，遗传距离为0.026；经序列比对，太湖花鳖群体和太湖鳖群体共有32处碱基的差异，其中转换26个，颠换5个，核苷酸的替换位点主要以转换为主，碱基转换与颠换比为5.2，表现出较高的转换偏倚（见表2）；太湖花鳖群体Cytb碱基的缺失位点为0处，而太湖鳖群体为1处.

2.4 D-loop区基因序列分析

中华鳖太湖花鳖群体和太湖鳖群体的D-loop区扩增产物大小均为481 bp，两个群体的D-loop区相似度为98.83%，遗传距离为0.022；经序列比对，太湖花鳖群体和太湖鳖群体两序列共有6处碱基的差异，其中转换5个，颠换1个，核苷酸的替换位点主要以转换为主，碱基转换与颠换比为5.0，表现出较高的转换偏倚（见表2）；两个群体D-loop区碱基的缺失位点均为0处.

3 讨论

群体间的遗传距离是衡量群体遗传分化的重要指标［10］. 根井正利［11］根据遗传距离数值对物种不同分类单位间的遗传分化水平做出定量估算，得出种群间遗传距离值的范围是0~0.05，亚种间是0.02~0.2. 本研究中，根据线粒体DNA的16S rRNA基因、12S rRNA基因、细胞色素b（Cytb）基因和D-loop区测序分析的中华鳖太湖花鳖群体和太湖鳖群体的群间遗传距离分别为：0.023，0.026，0.026和0.022，均小于0.05且大于0.02，说明两个群体之间亲缘关系相对较近，还未达到种间差异，但两者已经产生了一定程度的遗传分化，已经达到亚种水平. 太湖花鳖群体和太湖鳖群体线粒体DNA的16S rRNA基因、12S rRNA基因、细胞色素b（Cytb）基因和D-loop区的基因序列比对相似度同样也得出了以上结论. 太湖花鳖属于中华鳖的地方特色品种，与中华鳖普通品种在形态上存在较大不同，本文研究中两者遗传分化程度虽然还没有达到种间水平，但已经产生了明显的遗传趋异，可以认为已经分属于不同的亚种群. 当然，太湖流域中华鳖太湖花鳖群体与太湖鳖群体之间分类关系的确定，除了分子和形态方面的研究，还有赖于组织和细胞水平方面的研究予以论证.

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Abstract:In the present study, the variation and genetic diversity of mtDNA partial sequences including 16S rRNA, 12S rRNA, Cytb and D-loop region from Pelodiscus sinensis Taihu flower population and P. sinensis taihu population were analyzed. The results showed that genetic similarity between two different populations of P. sinensis in Taihu basin were 97.33%, 98.19%, 97.34% and 98.83%, respectively and that the genetic distances were 0.023, 0.026, 0.026 and 0.022, respectively. The results indicated a certain degree of genetic differentiation between the two populations of P. sinensis in Taihu basin, which achieved the subspecies level, though relatively similar, but not the speciation level.

Key words:Pelodiscus sinensis; 16S rRNA; 12S rRNA; Cytb; D-loop

A Comparative Analysis of Mitochondrial Genome Sequence from Different Populations of Pelodiscus sinensis in Taihu Basin

HAN Xiaolei1, GU Yi2, XU Mianmian1, SHA Yongliang2, XU Jianrong1, HAN Yaoping1
(1. School of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500; 2. Taicang Xihuchuan Aquaculture Professional Cooperatives, Taicang 215400, China)

Q959.63

A

1008-2794（2017）04-0091-04

2017-02-20

江苏省科技支撑计划（农业部分）项目“大规格仿野生中华鳖生态养殖技术示范与推广”（BE2013349）

韩曜平，教授，博士，研究方向：水产品生态养殖技术，E-mail：975683768@qq.com.