霍山石斛水溶性多糖抗亚急性酒精性肝损伤研究

聂春艳 汪鹤 潘利华 查学强 罗建平

摘要[目的]研究霍山石斛水溶性多糖抗小鼠亚急性酒精性肝损伤的作用。 [方法]制备霍山石斛水溶性多糖；以连续灌胃30%乙醇（V/V，10 mL/kg）15 d的小鼠为亚急性酒精性肝损伤模型，水溶性多糖连续灌胃30 d后，称量小鼠体重和肝脏重量，观察肝组织损伤病理变化，并检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）活性以及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）的含量，同时测定肝脏中乙醇脱氢酶（ADH）、乙醛脱氢酶（ALDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性以及还原性谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量。 [结果]霍山石斛水溶性多糖各剂量可有效抑制酒精引起的小鼠血清中ALT、AST、ALP、HDL-C、LDL-C、TC、TG水平的变化，增强肝组织中ADH、ALDH、SOD、GSH-PX的活性，抑制肝组织中GSH含量的降低和MDA含量的升高，减轻酒精对肝脏的病理损伤。 [结论]霍山石斛水溶性多糖对亚急性酒精性肝损伤具有显著的保护作用。

关键词霍山石斛；水溶性多糖；亚急性酒精性肝损伤

中图分类号Q946.3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）17-0100-06

Abstract[Objective] The research aimed to investigate the effects of watersoluble polysaccharide from D. huoshanense against alcoholinduced subacute liver injury in mice. [Method]Watersoluble polysaccharide from D. huoshanense was prepared.The mouse liver injury was induced by oral administration of 30% alcohol for 15 days and watersoluble polysaccharide was employed to intervene this injury for 30 days. Liver injury was evaluated by mouse body weight， liver weight， liver pathological changes， serum biochemical indexes including alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， alkaline phosphatase （ALP）， high density lipoprotein cholesterol （HDLC）， low density lipoprotein cholesterol （LDLC）， total cholesterol （TC）and triglyceride （TG）， and liver biochemical indexes including alcohol dehydrogenase （ADH）， acetaldehyde dehydrogenase （ALDH）， superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSHPX）， glutathione （GSH） and malonaldehyde （MDA）.[Result]Watersoluble polysaccharide from D. huoshanense effectively suppressed the change of ALT， AST， ALP， HDLC， LDLC， TC and TG levels in serum， enhanced the activities of ADH， ALDH，SOD and GSHPX in liver， inhibited the decrease in GSH level and the increase in MDA level in liver，and reduced the pathological damage of alcohol to the liver.[Conclusion]Watersoluble polysaccharide from D. huoshanense showed significant hepatoprotective effects against alcoholinduced subacute liver injury.

Key wordsDendrobium huoshanense；Watersoluble polysaccharide；Subacute alcoholic liver injury

基金項目安徽省科技攻關计划项目（12010402088）。

作者简介聂春艳（1992—），女，湖南常德人，硕士研究生，研究方向：中草药与功能食品。

收稿日期2017-04-06

长期过度饮酒容易导致酒精性肝损伤已成为国内外共识[1-2]。大量的试验研究表明，许多中草药具有改善酒精性肝损伤的功效[3]。霍山石斛（Dendrobium huoshanense）作为传统的药食兼用植物[4]，具有益胃生津、滋阴清热、保肝明目等功效[5]。有研究显示，多糖作为石斛的主要活性成分之一，具有一定的酒精性肝损伤保护作用[6]。霍山石斛、铁皮石斛等多种石斛粗多糖具有一定的预防急性和亚急性慢性酒精性肝损伤的效果[7]，霍山石斛的不同提取方式在保护肝损伤的功能上具有一定的差异[8]。笔者主要以霍山石斛经醇提、水提醇沉、DEAE纤维素阴离子色谱柱分离得到的水溶性多糖为研究对象，以亚急性酒精性肝损伤小鼠为试验动物模型，研究霍山石斛水溶性多糖抗小鼠亚急性酒精性肝脏损伤的作用和可能机制，旨在明确霍山石斛水溶性多糖对酒精性肝损伤的干预作用，为霍山石斛在抗酒精性肝损伤方面的加工应用提供参考价值。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物。

健康昆明雄性小鼠，体重（20±2）g，SPF级，购于安徽医科大学动物实验中心。

1.1.2试材。

霍山石斛采自安徽霍山。

二乙氨基乙基纤维素（diethylaminoethyl cellulose，DEAE），美国Sigma公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）试剂盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所；水飞蓟素，德国马博士；其他试剂均为分析纯。

1.1.3仪器与设备。

CT15R高速冷冻离心机，上海天美科学仪器有限公司；Hei-VAP Advantage旋转蒸发仪，德国Heidolph公司；SHZ-D循环水式真空泵，巩义市英予华仪器厂；LBJ-18S原位真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；7072自动生化分析仪，日本日立高新技术公司；RM2126组织切片机，德国莱卡公司；XSZ-3G普通光学显微镜，重庆广电仪器有限公司；Varioskan Flash酶标仪，美国Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1霍山石斛水溶性多糖的提取。

取霍山石斛鲜品经真空冷冻机冻干、粉碎机粉碎成粉末状、80%乙醇脱脂后，按1∶60（m∶V）料液比加入蒸馏水，75 ℃搅拌浸提2 h，重复2次，提取液在60 ℃下适度减压浓缩，经离心（20 ℃，8 000 r/min，10 min）取上清液。上清液经终浓度为80%的乙醇醇沉24 h，收集沉淀，依次经Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1）脱除蛋白[9]、截留分子质量为3500 D透析袋透析过夜除去小分子、真空冷冻干燥获得霍山石斛粗多糖。采用DEAE-纤维素阴离子交换柱（1.6 cm × 60 cm）对粗多糖进行分离，收集水洗脱组分，经浓缩、透析、冷冻干燥后，得霍山石斛水溶性多糖。

1.2.2动物分组及给药方法。

先将试验小鼠适应性饲养（正常饮食饮水）7 d，再随机分为6组，分别为正常对照组、酒精性肝损伤模型对照组、阳性对照组（水飞蓟素20 mg/kg），霍山石斛水溶性多糖高[0.064 g/（kg·d）]、中[0.021 g/（kg·d）]、低剂量组[0.011 g/（kg·d）]，每组10只。其中结合霍山石斛水溶性多糖的提取得率，以《药典》中石斛干品的人体（60 kg）推荐摄入量（6～12 g/d）中间量（10 g/d）的30倍、10倍、5倍为依据，确定霍山石斛多糖水溶性多糖高、中、低剂量组的给药浓度。霍山石斛组与阳性对照组每日一次按10 mL/kg剂量灌胃小鼠，正常对照组和模型对照组小鼠给予相同体积蒸馏水，连续灌胃30 d。于第1天记录小鼠初始重量，从第16天开始，除正常组外，其他各组于每天给药结束后4 h灌胃30%酒精（10 mL/kg）[10]。最后一次给药结束后，记录最终重量，小鼠禁食12 h，注射60 mg/kg戊巴比妥钠溶液将小鼠麻醉，腹主动脉取血，解剖取出肝脏，称重，迅速用液氮冻存，保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.3小鼠体重和肝脏指数的测定。

小鼠体重增重=（第30天体重-第1天体重）/第1天体重×100%；

肝脏指数 = 肝脏重量（mg）/体重（g）。

1.2.4小鼠肝组织病理学检查。

先用預冷的PBS冲洗小鼠肝脏表面血渍，取肝脏左叶用10%福尔马林浸泡，固定过夜，按常规方法依次脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色，在普通光学显微镜（20×）下观察肝脏病理学变化，包括肝细胞形态变化和肝脏变性坏死程度等。

1.2.5小鼠血清生化指标检测。

小鼠腹主动脉取血约0.5 mL于EP管中，于4 ℃冰箱静置过夜，4 ℃ 、4 000 r/min离心20 min，移液枪吸取上层淡黄色液体，得到血清。采用全自动生化分析仪检测肝功能活性指标即谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）的活性，脂质代谢指标即高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量。

1.2.6小鼠肝组织生化指标检测。

于-80 °C冰箱取出肝脏组织置于匀浆器中，加入0.9%生理盐水研磨后，稀释成质量浓度为10%的肝脏组织匀浆液，于4 ℃、10 000 r/min离心15 min，分离上清，待测。

①抗氧化应激指标的测定：抗氧化酶（SOD和GSH-PX）的活性以及还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量严格按照试剂盒说明书测定。

②酒精分解酶活性的测定：乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）活性按照Koivisto等[11]的方法检测。

1.3统计分析

通过SPSS 17.0软件，采用t检验方法，进行数据统计学分析，结果以±S表示。

2结果与分析

2.1水溶性多糖对小鼠体重增重和肝脏指数的影响

由图1a可知，与正常对照组相比，酒精性肝损伤模型对照组的小鼠体重增加量明显减少（P<0.01）；与模型对照组比较，阳性对照组与霍山石斛水溶性多糖中、高剂量组均能显著恢复酒精抑制的小鼠体重增加（P<0.05），霍山石斛水溶性多糖低剂量组虽然具有恢复小鼠体重的趋势，但统计数据无显著性效果（P>0.05）。水溶性多糖对小鼠肝脏指数的变化分析表明（图1b），与正常对照组比较，模型对照组肝脏指数极显著升高（P<0.01），但这种升高可被霍山石斛水溶性多糖各剂量组显著抑制。

2.2水溶性多糖对小鼠肝组织形态的影响

从图2可看出，酒精肝损伤模型组小鼠肝细胞肿胀，细胞核固缩、溶解，细胞索排列呈无序状态，肝小叶界限不清晰，肝组织出现炎性和坏死区，导致肝损伤。而霍山石斛水溶性多糖各剂量组的肝损伤程度明显减轻，高剂量效果比阳性对照组更好，肝小叶结构清晰可见，界限分明，肝细胞排列呈现有序状态，脂肪变性程度明显降低，坏死区域显著缩小，核仁清晰。

2.3水溶性多糖对小鼠肝功能的影响

由图3可知，与正常对照组比较，模型组小鼠在酒精下血清中ALT、AST、ALP活性极显著增高（P<0.01）；与模型对照组相比，阳性对照组能明显抑制ALT活性变化（P<0.05）及AST和ALP活性升高（P<0.01）；霍山石斛水溶性多糖各剂量组均能极显著抑制酒精致肝损伤小鼠血清中ALT、AST、ALP活性的升高（P<0.01），且呈剂量效应关系，其中高剂量组与模型对照组相比分别降低42.2%、30.8%、37.1%。结果表明，水溶性多糖抑制血清中ALT、AST、ALP活性升高，从而修复肝细胞膜通透性、保护小鼠肝功能。

2.4水溶性多糖对小鼠脂质代谢的影响

由图4可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠脂质代谢出现紊乱，小鼠血清中HDL-C含量显著降低，LDL-C、TC、TG明显升高（P<0.01）。与模型对照组相比，水溶性多糖各剂量组均可显著地恢复酒精引起的HDL-C水平降低，以及LDL-C和TG含量的升高（P<0.01），且具有剂量效应关系，水溶性多糖低剂量组和中剂量组可一定程度地恢复血清中TC含量（P<0.05），水溶性多糖高剂量组可显著抑制TC水平的升高（P<0.01），其中水溶性多糖各剂量组的LDL-C和TG含量接近于正常组水平，说明霍山石斛水溶性多糖在恢复脂质代谢异常中发挥重要作用。

2.5水溶性多糖对小鼠肝脏抗氧化能力的影响

由图5可知，酒精致小鼠肝损伤中肝组织SOD、GSH-PX活性和GSH含量显著降低，MDA含量明显增加（P<0.01），而水溶性多糖各剂量组均能明显改善酒精致小鼠肝组织中抗氧化酶活性和抗氧化物质的变化（P<0.01），其中高剂量组表现出更好的抗氧化能力，与模型对照组相比，SOD、GSH-PX和GSH分别提高了80.9%、51.0%、33.8%，MDA含量减少了454%。表明水溶性多糖对酒精致小鼠肝组织SOD、GSH-PX、GSH和MDA水平的改变具有很好的改善作用，可保护肝组织抗氧化系统的平衡。

2.6水溶性多糖对小鼠肝脏酒精分解酶活性的影响

由图6可知，与正常对照组相比，酒精刺激小鼠肝组织中ADH和ALDH活性升高（P<0.01），而口服霍山石斛水溶性多糖可进一步提高ADH和ALDH活性（P<0.01）。表明霍山石斛水溶性多糖各剂量组均能适应肝组织快速代谢酒精和减轻酒精毒性的需求，从而抑制肝脏的损伤。

3讨论与小结

参与酒精性肝损伤的发病机制比较复杂，涉及乙醇及其代谢产物、氧化应激、脂质过氧化等多因素的共同作用[12]。当长期过量摄入酒精后，容易导致亚急性肝损伤，引起机体重量、酒精代谢酶活性、抗氧化能力和脂质代谢等一系列异常反应，从而导致肝细胞的功能损伤[13]。

长期大量饮酒会降低食欲和对营养成分的吸收能力，导致体重增重明显下降和肝脏指数显著增加，肝组织出现细胞肿胀和排列无序[14]。该试验通过对小鼠体重及肝脏指数的数据统计和方差分析发现，霍山石斛水溶性多糖能明显改善由酒精引起的小鼠体重减轻及肝脏指数增加，肝组织病理学检查发现水溶性多糖能一定程度地减轻肝细胞病理损伤程度，表明水溶性多糖对长期过量饮酒所致的肝损伤有保护作用。

ALT、AST和ALP是存在于肝細胞浆和线粒体中3种重要的转氨酶[15]，乙醇及代谢产物乙醛在体内的积累引起肝细胞发生病变，使得肝细胞膜通透性和流动性增加，导致血液中3种转氨酶活性升高[16]。该研究显示，水溶性多糖干预组可以改善酒精所致的肝功能损伤，血清中ALT、AST和ALP活性显著下降，从生化功能上提示霍山石斛水溶性多糖对酒精性肝损伤具有保护作用。

脂质代谢异常作为酒精性肝损伤的一种并发症状，即酒精及代谢产物会导致血液中HDL-C含量降低的同时引起LDL-C、TC和TG含量增加，从而出现常见的高血脂和脂肪肝的病症[17]。该试验发现，霍山石斛水溶性多糖具有明显抑制酒精致小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TC和TG含量的变化，表明水溶性多糖具有改善酒精导致的肝组织脂质代谢异常的功效。

乙醇代谢过程中会产生大量活性氧，抑制GSH的生物合成，降低肝脏内抗氧化系统GSH-PX的活性，减弱SOD的抗氧化功能，增加膜脂质过氧化产物MDA含量，从而引起氧化-抗氧化状态的失衡，出现氧化应激反应，造成肝脏损伤[18-19]。该试验表明，灌胃霍山石斛水溶性多糖能通过提高SOD和GSH-PX的活性、GSH的含量以及降低MDA的水平来维持肝组织的抗氧化体系平衡状态，从而减轻酒精引发的肝组织氧化损伤。

乙醇在机体内的主要代谢器官是肝脏，代谢过程中主要有ADH和ALDH 2种酶参与发挥作用，因此ADH和ALDH活性的变化对于肝脏损伤具有重要的作用[20]。该试验结果表明，霍山石斛水溶性多糖可以显著提高小鼠肝组织ADH和ALDH的活性，加快酒精及其代谢产物的氧化、水解、排出，从而减轻代谢产物乙醛对肝细胞的毒性作用，达到改善酒精性肝損伤的效果。

综上所述，霍山石斛水溶性多糖可在血清肝功能、脂质代谢以及肝组织酒精代谢酶和抗氧化体系等方面共同干预和恢复酒精性肝损伤。

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