端粒酶mRNA转染对于软骨组织活性提高作用的研究

吴海涛

摘要：目的：研究端粒酶mRNA转染对于软骨组织活性的提高作用。方法：选用大鼠的软骨组织细胞，采用电染法实现端粒酶mRNA转染，从而进行对照研究。结果：转染后，软骨组织细胞端粒酶活性增强，具有较强生长能力。结论：端粒酶mRNA转染对于软骨组织活性提高具有积极作用，具有进一步研究的价值。

关键字：端粒酶；软骨组织；电转染；活性提高作用；mRNA

前言

软骨组织在人体中广泛存在于骨组织的末端，是人体骨骼的主要保护组织，可使骨骼之间避免摩擦及冲击。软骨组织是由胶原组织、少许细胞、以及60-80%的水份等成份所构成，成人的软骨组织中并无神经和血管，因此软骨组织受伤后自行修复能力较差，容易在各种损伤作用下产生软骨组织损伤，进而导致各种软骨组织疾病的发生。

软骨组织损伤性疾病是临床多发疾病，自青壮年至老年 均可发病，发病率较高，是引起劳动力致残的原因之一。软骨组织损伤性疾病的治疗有保守治疗及手术治疗，但目前治疗均不能从根本上去除病患。多种因素均可导致软骨组织损伤性疾病的发生，如创伤、遗传等。软骨组织细胞在维持软骨组织生理功能中发挥重要作用，在软骨损伤疾病的发生发展中扮演着重要角色。软骨组织细胞随着年龄的增长，生物学功能逐渐减低。老年人群中软骨组织损伤性疾病发病率非常高，这可能和老年患者软骨组织细胞功能下降有关。目前已 有研究者探索软骨损伤性疾病的细胞治疗。

端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构，由端 粒DNA和端粒蛋白质组成，其功能是完成染色体末端的 复制，防止染色体融合、重组和降解[1-2]。在大多数正常 体细胞，由于所谓的“末端复制问题”，端粒随每次细胞分裂而缩短。当端粒缩短到临界长度时，即会造成细胞 静止或凋亡，称之为细胞衰老。但在生殖细胞和肿瘤细 胞等永生化细胞中，一般通过一种细胞内反转录酶—— 端粒酶的作用，端粒的长度维持稳定[3]，因此保证了这些 细胞的无限分裂。

端粒酶有3个组成部分：端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白和端粒酶催化亚基。端粒酶RNA是合成端粒的模板，也是相关蛋白的结合支架，人端粒酶反转录酶是含有7个 基元的转录酶，表现聚合酶活性，在无细胞的情况下将 端粒酶RNA和人端粒酶反转录酶混合在一起即可表现端 粒酶活性，而端粒酶相关蛋白与端粒长度调节和端粒酶活性无关[4]。由于端粒酶RNA在细胞中大量存在。因此，端粒酶活性主要由人端粒酶反转录酶决定。许多研究者 利用外源性人端粒酶反转录酶基因”[5-9]。

文章期望通过将外源性人端粒得多种细胞“永生化酶反转录酶基因介导入软骨组织细胞中，从而增强软骨组织细胞的生物学特性，延长其在体外的传代时间及增殖能力，并保持细胞的细胞表型，即所谓的“永生化”。

材料与方法

设计：细胞学体外观察实验。

实验材料：Wistar大鼠9只，雌雄不限，体质180-200g。实验过程中对动物处置方法符合动物伦理学要求。

实验方法：

1、软骨细胞的分离纯化和鉴定

无菌环境下分离其胫骨及股骨，去除周围附着的软组织，并将干骺端与骨连接处2 mm的组织剪下，修整为1 mm×1 mm× 1 mm小块，放入D-Hanks液中漂洗，用吸管将其移至 离心管中，1 000 r/min离心8 min，弃去上清，用胰酶重悬细胞，37 ℃水浴箱中消化5 min，再次离心，弃上清，加入0.1% Ⅰ型胶原酶重悬细胞后移至培养瓶中消化过夜，将消化液过滤去掉未消化的组织块，离心，去上清，D-Hanks液重悬细胞，将细胞接种至含体积分数为 10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养，放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中。

洗细胞2次，离心去上清，加入磁珠Buffer溶液重悬，加入羊抗兔IgG免疫磁珠10μL孵育，离心去上清，用磁珠 Buffer溶液清洗细胞2次，加入磁珠Buffer溶液重悬，将细胞悬液缓缓滴入位于磁场中的分离柱内，待悬液缓缓通过分离柱后，用Buffer缓缓冲洗，将阴性细胞洗脱。移开磁场，用Buffer溶液快速冲洗分离柱，将FGFR-3阳性细胞洗脱，即为软骨细胞。然后再次离心去上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞，将细胞接种于培养瓶中，放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养。取部分做爬片，固定，用免疫组化法对其进行鉴定。

2、端粒酶反转录酶基因电转染

培养24 h后取 对数生长期细胞，将其制成单细胞悬液，PBS冲洗，胰酶消化，离心，收集前软骨干细胞，加入电穿孔缓冲液使其重悬，离心800×g，静置5 min，清洗细胞3次，离 心，重懸于电转液中，转移至电击杯，加入20 μg质粒 DNA，轻轻混匀，静置于冰上30 min，以电压350 V/cm，电容25 μF，时间常数T为0.9 ms的电转化参数进行电穿孔。将转染后的前软骨干细胞在室温中放置30 min，移入DMEM培养基中放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养 箱中培养。以转染空质粒为阴性对照序列组，对照组未进行转染。

3、TRAP-ELISA法检测软骨细胞端粒酶活性

采用Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA Kit试剂盒按 说明书测定软骨细胞端粒酶活性，在Ep管中加入 2×105 细胞，在4 ℃条件下按照3 000×g标准离心10 min，去除上清，加入200 μL Solution 1，依据16 000×g标准 离心20 min，吸取1-3 μL上清于一新的Ep管中，加入 25 μL Solution 2；取3 μL细胞提取物于85 ℃灭活10 min 作为阴性对照；在各管中加入Solution 6 使总体积至 50 μL；将样本进行扩增，整体反应温度及时间为：25 ℃ 10 min →个循环94 ℃ 1 min→30（94 ℃30 s 30 s→50 ℃ →72 ℃；取 30 s）→72 ℃ 10 min PCR扩增产物5 μL进行 ELISA实验，使用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值。

4、RT-PCR检测端粒酶反转录酶mRNA的表达

按照Trizol试剂说明书中的具体步骤提取各组细胞的总RNA，以紫外分光光度计检测样品吸光度并计算纯度及 浓度。根据反转录合成试剂盒说明书进行反转录，PCR反应条件：95 ℃-94 5 min ℃-55 30 s ℃-72 40 s℃ 30 s，36个循环，72 ℃延伸7 min。每一PCR反应重复 3次。

将所得PCR产物在4 ℃条件下进行琼脂糖凝胶电 泳，在凝胶自动成像仪上拍照提取图像。以β-actin作为 内参照。

5、CCK-8法检测细胞生长情况

将各组细胞接种 在96孔板上，每孔100 μL，每组设3个平行孔，于37 ℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养48 h，弃掉细胞培 养液，加入CCK-8 10 μL，于培养箱温育2 h，在酶标仪 上测定吸光度值。

6、生长曲线测定

将各组同一时期转染前后的前 软骨干细胞制成单细胞悬液，按每孔2.0×104 细胞密度 接种于24孔板，每组设置3个复孔，置于37 ℃、体积分 数为5%CO2孵箱培养。从培养的第2天起，每天同一时 间消化3个孔，进行精确计数，连续5 d后绘制各组细胞 的生长曲线。

结果

首先采用TRAP-ELISA检测各组细胞端粒酶活性，结果显示：与阴性对照序列 组和对照组相比，人端粒酶反转录酶转染组细胞端粒 酶蛋白表达上调，阴性对照序列组和对照组细胞端粒 酶蛋白表达差异无显著性意义（P > 0.05）。

转染48 h后，与对照 组、阴性对照序列组相比较，人端粒酶反转录酶转染组软骨细胞的吸光度值显著升高，差异有显著性意义（P < 0.05）。与对照组、阴性对照 序列组相比较，人端粒酶反转录酶转染组的S期细胞明 显增多；与对照组、阴性对照序列组相比较，G1期细胞 在人端粒酶反转录酶转染组明显减少，差异有显著性意 义（P < 0.05），M期细胞无明显变化。

与对照组、阴性对照序列组比较，人端粒酶反转录酶转染组软骨细胞的增殖能力显著增强，差异有显著性意义（P<0.05）。

讨论

软骨组织疾病的成因主要由于软骨组织在损伤后的修复能力缺失，因此可以将提高软骨组织活性作为软骨组织疾病的治疗方向加以研究。端粒酶既能够延长端粒的末端，使其寿命得以增长，又能够维持其长度[10-11]正常人體细胞中不能检测出端粒酶活性的表达[12-13]，其表达 的多少主要决定因素是人端粒酶反转录酶[14-16]。近年来的 研究发现，正常人体中人端粒酶反转录酶的表达受到抑 制，且其表达是调控人端粒酶活性的重要因素[17-19]。

人端粒酶反转录酶转染 对其在软骨细胞的表达有明显促进作用，并且不影响 其他亚单位的表达，与有关研究结果一致[14-19]。在对照组、阴性对照序列组中，人端粒酶反转录酶 mRNA 表现为阴性，启动子未被激活。在转染组中前软骨干细胞启动子的 活性、mRNA表达处在较高水平[20-22]，使端粒酶活性增加，端粒长度得以保持，延缓衰老。同时该研究亦证实人端粒 酶反转录酶可以加速软骨细胞的增殖，诱使其发生永生化，与以往相关文献研究相符合[23-25]。

综上所述，将人端粒酶反转录酶转染软骨细胞，可以明显提高端粒酶活性，S 期细胞明显增多。因此，可通过人端粒酶反转录酶转染来促进软骨细胞增殖，进而达到治疗软骨损伤的目的。

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