电刺激对铁皮石斛原球茎中石斛碱含量的影响

何清英 罗志华 林棉杰 陈俊杰 邓秋怡 温斌 陈珺

摘要 [目的]探讨电刺激对铁皮石斛原球茎中石斛碱含量的影响。[方法]采用铁皮石斛原球茎培养基扩增培养铁皮石斛原球茎，并将扩增所得原球茎随机分为试验组和对照组，其中试验组给予不同时间电刺激（25 V），对照组不做处理，正常培养15 d后，以氯仿热回流法提取原球茎中的石斛碱，紫外分光光度法测定石斛碱含量。[结果]与对照组相比，经电刺激（25 V）1 和2 h的试验组铁皮石斛原球茎石斛碱含量显著增加（P<0.05），而经电刺激（25 V）3 h的试验组铁皮石斛原球茎石斛碱含量下降（P<0.05）。[结论]25 V电刺激1、2 h能够促进铁皮石斛原球茎中的石斛碱积累，这可能与电刺激能改变原球茎中细胞的渗透性、增强对培养基中各种成分的吸收，导致内源次生代谢物增加有关。

关键词 铁皮石斛；原球茎；电刺激；石斛碱；紫外分光光度法

中图分类号 S567.23+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）07-0114-02

Effects of Electrostimulation on Dendrobine Content in Protocorm of Dendrobium officinale

HE Qing-ying， LUO Zhi-hua， LIN Mian-jie， CHEN Jun* et al

（School of Biosciences and Biopharmaceutics， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou， Guangdong 510006）

Abstract [Objective] To investigate the effects of electrostimulation on dendrobine content in protocorm of Dendrobium officinale. [Method] Protocorms were cultured by protocorm culture medium and randomly divided into two groups， the experimental group was treated with electrostimulation（25 V） while the control group did not be disposed. After 15 days incubation， dendrobine was extracted by chloroform and hot-refluxing， and determinated by ultraviolet spectrophotometry. [Result] Compared with the control group， the dendrobine content of experimental group treated with electrostimulation（25 V） for 1 h or 2 h was increased significantly（P<0.05）， while the dendrobine content was decreased（P<0.05） in experimental group treated by electrostimulation（25 V） for 3 h. [Conclusion] The electrostimulation（25 V） for 1 h or 2 h can promote the accumulation of dendrobine in protocorm， and the mechanism may be related to the changed permeability of cell， the enhanced absorption of nutrients and the increased endogenous secondary metabolites.

Key words Dendrobium officinale；Protocorm；Electrostimulation；Dendrobine；Ultraviolet spectrophotometry

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是兰科石斛属多年生附生草本植物，具有滋阴、益胃、生津止渴、润肺止咳、强壮及增强免疫活性的作用。石斛碱作为铁皮石斛药用成分之一，具有抗肿瘤、抗衰老等作用[1-2]，但铁皮石斛中石斛碱的含量相对较少[3]，因此，通过探寻合适的方法来提高石斛碱含量具有重要的意义。

近年来，电刺激对植物生长的影响研究就一直受到关注[4-6]，潘学武等[7]研究发现微交流电刺激可使红豆杉悬浮培养细胞的紫杉醇含量提高3倍多，而脉冲电刺激处理组则提高了7～9倍。为了探究电刺激法是否可以运用于提高铁皮石斛原球茎的石斛碱含量，该研究通过使用25 V交流电对铁皮石斛原球茎进行不同时间段的刺激，并且培养15 d后，检测其石斛碱含量。

1 材料与方法

1.1 试材

铁皮石斛原球茎，购自澄思源生物科技（上海）有限公司，经鉴定为天目山铁皮石斛原球茎。铁皮石斛石斛碱标准品（MUST-12080608），纯度99.99%，购自广州市药检所；溴甲酚绿（天津市大茂化学试剂厂，20130510）。

1.2 主要仪器设备

电刺激仪—交流变压器（上海征西电气科技有限公司，BK-200VA型），分析天平（中韓合资科威电子仪器有限公司，AK-1200型），紫外可见光分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司，WFZ UV-2000型]。

1.3 试验方法

1.3.1

铁皮石斛原球茎的扩增培养。参考前人研究的原球茎的增殖扩增培养方案[8-10]，结合以往经验，设计了9种不同的MS培养基（表1），分别进行原球茎扩增培养，得出最佳扩增培养基配方，此配方也用于后续电刺激试验后的继续培养。

1.3.2

标准曲线绘制。参照徐宁[11]的方法，精称石斛碱对照品5 mg，置50.0 mL容量瓶，加氯仿定容至刻度，配成100 mg/L的石斛碱氯仿溶液，分别在6个10 mL容量瓶中加入石斛碱氯仿溶液0、1、2、3、4、5 mL，用氯仿定容至10 mL，将容量瓶中的溶液移至分液漏斗中，再加入pH缓冲液5.0 mL和1.0 mL 0.04%溴甲酚绿溶液，剧烈振摇3 min，静置30 min，将氯仿层通过药棉（事先已浸泡过氯仿并干燥）过滤，取续滤液5.0 mL，再加入0.01 mol/L氢氧化钠无水乙醇溶液1.0 mL，充分摇匀，于波长620 nm处测定吸光度，以所测得的吸光度为纵坐标、对应的石斛碱浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.3

电刺激试验与原球茎样品制备。

1.3.3.1

铁皮石斛原球茎的电刺激试验。选取同一批次扩增培养的铁皮石斛原球茎，随机均分等量平行进行3次试验，随机分为6组：1 h试验组与1 h对照组、2 h试验组与2 h对照组、3 h试验组与3 h对照组。试验组分别进行1、2、3 h电刺激处理，电刺激强度均为25 V；对照组不做电刺激处理，其余条件与试验组保持一致。将各组原球茎均接种至固体培养基中扩增培养15 d。

1.3.3.2

检测石斛碱含量。经扩增培养15 d后，取出各组原球茎，置于95～110 ℃温度下杀青0.5 h，60 ℃条件下干燥过夜，经研磨成粉，过60目筛备用。参照徐宁[11]的方法，称取样品粉末并记录重量。再用5 mL氨水浸湿样品30 min（保持密封状态），精密量取加入10.0 mL氯仿，并且称重记录。水浴回流加热2 h，冷却后称重，用氯仿补充至原重，摇匀，过滤，接收续滤液，并记录体积。精密量取3 mL续滤液并定容至10 mL容量瓶，按“1.3.2”方法，加入缓冲液和溴甲酚绿溶液，显色后，于波长620 nm處测其吸光度。

1.4 数据处理

所有参数均用x±S表示，用SPSS软件进行统计分析，LSD- t检验法比较组间的变量差异，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛原球茎的扩增培养基配方

多次试验发现，铁皮石斛原球茎在配方②MS固体培养基中（含2.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L NAA、3%蔗糖、0.7%琼脂）颜色翠绿、疏松，生长状态好，说明该配方适合原球茎扩增。因此，后续试验中均以此配方进行原球茎培养。

2.2 方法学考察

2.2.1

线性关系。按“1.3.2”方法绘制标准曲线，重复试验5次，以石斛碱浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线（图1），得出石斛碱的线性回归方程为y=0.006 7x+0.004 2（r=0.999 6），表明石斛碱浓度在1～5 μg/mL范围内线性关系良好，适用于计算样品中石斛碱含量。

2.2.2

显色稳定性试验。以石斛碱标准品制备供试品溶液（3.0 μg/mL），按线性关系标准曲线的制作方法操作，加入氢氧化钠无水乙醇溶液后，在0、15、30、60和120 min时分别测定溶液吸光度，结果发现，加入氢氧化钠无水乙醇30 min内显色稳定，超过30 min后变动较大，故需及时测定。这与李亚芳等[12]的研究结果一致。氢氧化钠的无水乙醇溶液主要是通过调整溶液pH而影响显色，因无水乙醇挥发性很强，要求加入氢氧化钠、无水乙醇溶液充分振荡混匀后即时测定，同批次试验时要安排好不同样品的测定顺序，确保显色反应时间一致。

2.2.3

精密度、重复性试验。以石斛碱标准品制备供试品溶液（3.0 μg/mL），分别进行精密度试验（取同一批供试品溶液连续测定5次）和重复性（取同一批供试品平行制备5份供试品溶液，分别测定）试验。结果发现，精密度试验中RSD为1.72%，表明该方法精密度良好；重复性试验中RSD为2.55%，表明该方法重复性良好。

2.2.4

回收率试验。取過60目筛后的铁皮石斛原球茎样品粉末，称重并从中分取2份各0.3 g，其中1份样品粉末按“1.3.3.2”方法制备成待测样品溶液并进行含量测定，测得吸光度并计算石斛碱含量M1；取另一份样品粉末，加入与M1质量相当的石斛碱标准品Ms，按“1.3.3.2”方法制备待测样品溶液并进行含量测定，测得吸光度并计算石斛碱含量M2，平行测定5组样品，计算回收率。由表2可见，平均回收率为109.33%，RSD为2.82%，表明该方法可行，且回收率较好。

2.3 电刺激对生物碱含量的影响

试验结果表明，试验组1（电刺激1 h）和试验组2（电刺激2 h）铁皮石斛原球茎的石斛碱含量均明显高于对照组（P<0.05）；而试验组3（电刺激3 h）的石斛碱含量显著低于对照组（P<0.05）。

3 讨论

辛明等[13]分析发现，不同干燥工艺（热风干燥、真空干燥、真空冷冻干燥、自然晾干）对石斛碱含量无影响，认为生物碱在石斛植物衰老死亡过程中其总量是不变的，因此电刺激后的石斛碱经高温杀青后采取热风干燥以保证时间效率。徐宁[11]、李亚芳等[12]的氯仿热提取方案能够有效提取出石斛碱，且经提取2、3 h的石斛碱含量无显著性差异，因此该试验采用2 h氯仿热回流提取样品中的石斛碱。

近几年来，国内外许多学者通过外加恒压或恒流的方式展开电刺激对植物生长影响的探究，即对植物外加高压静电场进行刺激或通过外加衡电流进行刺激。细胞在一定的刺激条件下，膜电位会发生瞬时变化，从而产生动作电位会对细胞的生长发育产生影响。从20世纪80年代开始就有学者探究电刺激对植物愈伤组织的影响[5-6，14-15]，如Rathore等[15]研究发现对烟草愈伤组织进行1×10-6A的电流刺激后，可以提高70%的生长速率。戴群等[4]分析发现小麦原生质体经微直流电刺激后对细胞团的形成有促进作用。潘学武等[7]研究发现脉冲电刺激可有效提高紫杉醇的胞外释放率，达对照组的4～5倍。而该试验结果表明，25 V电刺激1、2 h对铁皮石斛原球茎中有效成分石斛碱的含量有显著的促进作用（P<0.05），但电刺激3 h（25 V）对铁皮石斛原球茎中有效成分石斛碱的含量有显著的抑制作用（P<0.05）。赵剑等[6]认为外加电压影响了细胞的代谢以及多种酶活，初步分析同一电压不同时长下会产生不同的结果是因为在一定时间内电刺激影响了ATP的合成，增加了酶活，从而促进了原球茎中石斛碱含量的产生；超过一定时间后由于电极的发热导致温度上升，影响细胞代谢，降低酶活，导致原球茎中石斛碱含量的降低。表明电刺激法可以提高铁皮石斛原球茎中石斛碱含量。

参考文献

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