利用PCR—DGGE技术研究稻草与黑麦草混合青贮过程中菌群的动态变化

刘蓓一　丁成龙　乔伟艳　李健　许能祥　潘孝青　秦枫　张霞　顾洪如

摘要：为了探讨稻草与黑麦草混合青贮发酵过程中微生物的动态变化规律，以稻草、黑麦草为青贮原料，从青贮后1、5、12、21、31、61、99、154 d的稻草、黑麦草混合青贮样中取样，分别测定pH值，采用培养方法计数乳酸菌、酵母菌、霉菌数量的变化，使用PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术分析青贮过程中菌群组成多样性。结果表明：黑麦草与稻草混合青贮pH值在青贮初期下降迅速，乳酸菌数量在5d达到最高峰，然后逐渐下降，酵母菌数量呈先降后升再降等波动变化，稻草与黑麦草混合青贮过程中优势菌主要有植物乳杆菌（Lactoacillus plantarum）、类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、食窦魏斯氏菌（W. cibaria）、短乳杆菌（L.brevis），且随着青贮时间延长，优势菌数量下降。由结果可知，将DGGE和16S rRNA序列分析技术结合，能有效地研究青贮细菌的遗传多样性和组成的变化。

关键词：青贮；微生物培养；动态变化；PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）

中图分类号： S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）11-0123-04[HS）][HT9.SS]

秸秆的饲料化利用，是其资源化利用的有效途径之一，也是促进农区草食动物发展的重要措施。我国农作物秸秆总量达52 056万t以上，其中稻草21 129万t[1]。稻草与其他禾本科牧草青贮原料相比，干物质含量高，但茎叶上自然附着的乳酸菌数量少，可溶性碳水化合物含量低[2]，所以常规青贮很难调制出高品质的青贮料。多花黑麦草具有可溶性碳水化合物含量高、纤维素和木质素含量低的优点，但其含水量高，直接青贮容易产生大量的渗出液，导致青贮饲料酸度大，从而降低青贮饲料的营养成分[3]。水稻秸秆和黑麦草混合青贮，不仅能解决稻草可溶性碳水化合物含量低、青贮不易成功的问题，还能解决黑麦草水分含量高、不易青贮的问题。李君临等指出，黑麦草单独青贮不易成功，与水稻秸秆按7 ∶[KG-*3]3混合青贮时发酵品质最佳，显著降低了氨态氮占总氮的比例以及乙酸、丙酸和丁酸的含量[4]。青贮饲料是个复杂的微生物共生体系，主要包括乳酸菌、酵母菌、霉菌及其他腐败细菌[5]，而青贮饲料品质的优劣直接取决于乳酸菌的增殖与变化。在发酵初期，乳酸菌开始增殖，随着pH值的逐渐下降和厌氧程度的加强，乳酸菌在数量上逐渐形成绝对优势，其他微生物的生长受到抑制，乳酸菌产生大量乳酸，使pH值进一步下降，其他微生物的活性进一步减弱，当pH值下降到一定程度以后，乳杆菌的活性也受到了抑制[6]。可见，青贮过程中微生物数量及种群的动态变化研究十分重要。包慧芳等指出，玉米秸秆青贮饲料发酵过程中优势菌主要有植物乳杆菌（Lactoacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），且采用菌剂处理后青贮玉米pH值下降更快，其优势细菌种类更丰富[7]。詹发强等研究发现，乳杆菌属、片球菌属是青贮玉米发酵的启动菌之一，在发酵前期一直存在，但在发酵后期，乳杆菌属是玉米青贮过程中乳酸菌的主要菌群[8]。杨云贵等指出，在玉米青贮过程中，主要微生物随着青贮时间的延长呈现逐步减少的趋势，而乳酸菌在青贮第6、7天数量最高，之后呈现缓慢下降的趋势[9]。目前，有关黑麦草与稻草混合青贮发酵过程中微生物动态变化规律没有相关报道。

本研究通过跟踪微生物数量在稻草与黑麦草混合青贮过程中的变化情况，以及利用PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）方法对稻草与黑麦草混合青贮中细菌多样性进行研究，从而了解青贮发酵过程中微生物动态变化规律，以期为青贮微生物研究及复合型添加剂的研制提供科学依据。

1材料与方法

1.1青贮的制作与采样

将新鲜的多花黑麦草、水稻秸秆切短至2～3 cm，按多花黑麦草 ∶[KG-*3]水稻秸秆质量比=7 ∶[KG-*3]3进行混贮，用聚酯乙烯（52 cm×38 cm）青贮，每袋装至半袋（约500 g），没有加入添加剂，用真空封口机封口。分别于青贮后1、5、12、21、31、61、99、154 d开袋取样。

1.2青贮pH值测定

称取25 g样品，加入200 mL三角瓶中，加入700 mL蒸馏水后置于4 ℃冰箱内浸提24 h。然后通过2层纱布和滤纸过滤，测定滤液pH值。

1.3菌株分离培养方法

称取样品10 g放入已灭菌的小三角瓶中，加入90 mL无菌生理盐水，密封，在摇床上以120 r/min摇2 h。用1层无菌纱布过滤青贮草渣，然后逐级稀释，接种10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释梯度的悬浮液于MRS培养基（CM036，Oxoid）上，37 ℃厌氧培养48 h，计算乳酸菌数量。将梯度稀释的悬浮液接种于葡萄糖麦芽浸膏培养基上，30 ℃培养24 h，计算酵母菌数量。将梯度稀释的悬浮液接种于马铃薯培养基（CM0139，Oxoid）上，30 ℃培养24 h，计算霉菌数量。

选取MRS培养基上光滑、圆形、灰白色菌落进行乳酸菌计数；选取葡萄糖麦芽浸膏培养基上大而厚、湿润、表面光滑、多数不透明、黏稠、菌落颜色单调的菌落进行酵母菌计数；選取马铃薯培养基上菌丝细长，菌落疏松，呈绒毛状、蛛蛛网状、棉絮状菌落进行霉菌计数。对菌落数在10～100个的培养皿进行有效性计数：

[JZ]样品中活菌数A=N×D/m。

式中：N为菌落数，个；D为稀释倍数；m为取样量，g。

1.4青贮饲料菌群总DNA提取

取青贮饲料样10 g，加入90 mL无菌生理盐水，密封，在摇床上以120 r/min摇2 h。用1层无菌纱布过滤青贮草渣，8 000 g 离心15 min收集细菌菌体，然后按照DNeasy Tissue Kit（Qiagen，USA）说明书提取青贮饲料菌群的总DNA。

1.516S rDNA V3区域的PCR扩增

以纯化后的基因组DNA为PCR反应的模版，扩增16S rDNA V3区的基因，引物参照Muyzer，引物序列：F338，5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；R518，5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增片段为200 bp。

PCR反应体系（25 μL）：2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTP，2.5 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 10 μmol/L引物，0.2 μL 5 U/μL Taq DNA酶，加ddH2O至25 μL。

PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。用1.0%琼脂糖电泳检测PCR产物。

1.6DGGE分析

参照Muyzer等的方法[10]，将16S rDNA V3区的PCR扩增产物于8%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。变性剂浓度范围为45%～60%，变性梯度方向与电泳方向一致。电泳采用D-code DGGE系统（Bio-Rad），电泳缓冲液为1×TAE，240 V电压预电泳30 min，在恒温60 ℃下的1×TAE缓冲液中进行，80 V电泳15 h，电泳结束后用AgNO3染色，显色定影后用Vilber凝胶成像扫描系统照像。凝胶拍照成像后，用灭菌刀片切下含目的条带的凝胶块，将凝胶块转移至微量离心管中，用枪头将胶块捣碎，加入 50 μL ddH2O，98 ℃煮沸 10 min 后于4 ℃过夜。在进行第2次PCR前，于 12 000 r/min 离心5 min以上，吸取上清作为模板。

采用16S rRNA片段V3区引物（不带“GC”夹板）的F338、R518对DGGE胶上切下的目的条带进行第2次PCR扩增，反应体系、反应条件同“1.5”节。用1.0%琼脂糖电泳检测产物，用Axygen胶回收试剂盒回收目的条带。胶回收产物经pMD19-T载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB培养基上选择具有氨苄青霉素抗性的白色转化子，采用T载体通用引物进行菌落PCR检测，将菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.7序列分析

采用美國国立生物技术信息中心（NCBI）网站的BLAST程序（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列同源性分析。

2结果与分析

2.1青贮过程中pH值及微生物数量的变化过程

从表1可以看出，随着青贮时间的延长，黑麦草与稻草混合青贮pH值在青贮初期下降迅速，在青贮5 d时pH值降为4.76，12 d时pH值降为4.45，青贮12 d以后pH值下降缓慢；青贮乳酸菌数量在5 d达到最高峰，为9.50×107个/g，然后逐渐下降，到21 d时乳酸菌数量为8.50×106个/g，到 154 d 时乳酸菌数量只有5 200个/g；随着青贮时间的延长，酵母菌数量先降低，青贮后1 d酵母菌数量最高，达7.45×105个/g，到61 d时酵母菌数量最少，<100个/g；随着青贮时间的延长，霉菌数量迅速减少，直到青贮 5 d，霉菌数量小于100个/g。

2.2青贮细菌样品DGGE分析

从图1可以看出，青贮1 d时多样性最丰富；条带2在青贮后1 d存在，青贮5 d后该条带消失；条带3、4、8、9在青贮1至99 d持续存在，但随着青贮时间的延长，亮度减弱；条带5、6、7从青贮1至61 d持续存在；条带10存在于青贮12～ 61 d；条带11、12、13仅存在于青贮61 d；条带14、15、16、17仅存在于青贮154 d；条带18仅出现在青贮99 d。

回收上述优势条带和变化较明显的条带进行测序分析。由表2可知，条带2为植物乳杆菌（L.plantarum）；条带3、4、8、9分别为植物乳杆菌、类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、Uncultured bacterium、Uncultured Weissella；条带5、6、7分别为类肠膜魏斯氏菌、食窦魏斯氏菌（W. cibaria）、植物乳杆菌；条带10为短乳杆菌（L.brevis）；条带11、12、13分别为Uncultured Lactobacillus、植物乳杆菌、米酒乳杆菌（L.sake）；条带14、15、16分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）；条带17、18分别为阿耶波多杆菌（B. aryabhattai）、寡氧单胞菌（Stenotrophomones acidaminiphila）。

DGGE条带的亮度高低代表菌所占数量的多少。由表1可知，青贮1 d时乳酸菌数量占比较高。由图1可见，条带3（L.plantarum）、条带4（W. paramesenteroides）在青贮5 d时数量达到最大值；随着青贮时间延长，条带3、4的亮度降低，即L.plantarum与W. paramesenteroides随着青贮时间延长，数量占比下降；到154 d时，条带3、4很暗，主要菌群是B. licheniformis、B. aryabhattai，这与培养方法计数乳酸菌的结果一致，到青贮154 d时，乳酸菌的数量仅为5 200个/g（表1）。可以看出，稻草与黑麦草混合青贮过程中优势菌主要有L.plantarum、Weissella paramesenteroides、W. cibaria、L.brevis，故进行菌剂配伍改良时，可适当提高这4种菌的比例。

3讨论

3.1稻草与黑麦草混合青贮过程中pH值、乳酸菌的变化

pH值的高低是青贮饲料质量好坏的重要指标，质量良好的青贮要求pH值<4.5。在本试验中，随着青贮时间的延长，黑麦草、稻草混合青贮pH值在青贮初期下降迅速，在青贮5 d时pH值降为4.76，12 d时pH值降为4.45，青贮12 d以后pH值下降缓慢，61 d時pH值为4.21，说明青贮质量良好。与玉米青贮相比，黑麦草、稻草混合青贮pH值下降没有玉米青贮快。杨云贵等指出，玉米青贮的pH值在青贮2 d就能下降到4以下，然后稳定在3.5左右，且全株玉米青贮pH值低于秸秆玉米青贮[9]。即与玉米青贮相比，黑麦草、稻草混合青贮pH值下降没有玉米青贮快，可能是因为此试验中黑麦草与水稻秸秆是以质量比7 ∶[KG-*3]3混贮的，水稻秸秆含量比较高，而水稻秸秆可溶性碳水化合物含量低，导致本试验中pH值下降没有玉米青贮快。

青贮中乳酸菌是起主要作用的益生菌，它们在厌氧状态下将原料中的碳水化合物转化为乳酸。本试验中青贮乳酸菌数量在5 d达到最高峰，为9.50×107个/g，然后逐渐下降，61 d 时维持在106数量级。此结果与杨云贵等试验中玉米青贮过程中乳酸菌数量变化结果的趋势[9]相似。但Li等指出，凋萎多花黑麦草青贮过程中乳酸菌数量是先增加，到第7天时最大，随后降低，然后又增加、降低，而凋萎的羊草青贮过程中乳酸菌数量在第3天时已经达到最高峰，随着青贮时间的增加，乳酸菌数量变化得比较小[11]。

3.2稻草与黑麦草混合青贮过程中菌群的演替规律

从DGGE电泳结果可以看出，青贮1 d时多样性最丰富，青贮过程中，细菌种类经历了由多到少的变化且种类也发生了变化。韩吉雨等认为，玉米发酵过程中细菌种类只经历了由多到少的过程，而苜蓿青贮过程中细菌种类没有发生太大的变化[12]。这可能是由于物料的内部及外部结构不同导致的。

稻草与黑麦草混合青贮过程中优势菌主要有L.plantarum、W. paramesenteroides、W. cibaria、L.brevis。L.plantarum是同型乳酸菌[13]，是农作物青贮发酵过程中的主要优势菌[14]。Ennahar等指出，L.plantarum是水稻青贮的主要优势菌[15]。W. Paramesenteroides是传统发酵豆制品中的优势乳酸菌之一[16]。W. Paramesenteroides、L.brevis也是水稻秸秆发酵全混合日粮（TMR）和玉米秸秆发酵TMR中的优势乳酸菌[17]。W. Cibaria是水稻青贮中的优势菌，Pang等研究表明，水稻青贮的主要菌群是W.cibaria、W.confusa、L.lactis subsp.lactis和L.plantarum[18]。L.brevis是玉米秸秆的主要优势菌，占 23.7%[19]。而玉米秸秆青贮过程中主要的优势菌是Lactoacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus、Lactococcus lactis[7]。刘建新认为，青贮起始阶段，大肠杆菌大量增殖，直到第3天数量减少，被乳球菌（肠球菌、明串球菌、片球菌、四联球菌）代替，然后又被生长较慢、产酸较多的乳杆菌代替[20-21]。这与本试验过程中L.brevis出现在青贮12～61 d及L.sake仅出现在青贮61 d的结果是一致的。但是本试验在整个青贮过程中没有发现有乳球菌的存在。McEniry等研究发现，肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、明串珠菌（Leuconostoc carnosum）是青贮第2、6天的主要优势菌群[22]。Langston等也指出，在青贮早期存在明串珠菌属（Leuconostoc）菌[23]。但Li等指出，水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）、肠杆菌属（Enterobacter sp.）是多花黑麦草凋萎整个青贮过程中都存在的优势菌，Enterococcus faecium仅存在于青贮第7、28天，而青贮第120天时出现Pediococcus pentosaceus、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）这2种新的菌[11]。这可能是由于青贮本身材料的不同或添加乳酸菌等添加剂造成的青贮过程中菌群多样性的不同。李雁冰等的研究[24]也证实了这一点。

4结论

将DGGE、16S rRNA序列分析技术结合，能够非常有效地研究稻草与黑麦草混合青贮细菌的遗传多样性和组成的变化，进一步将其与发酵特性、传统培养等研究手段一起应该能更好地揭示青贮微生物的功能。

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