南瓜糖蛋白的分离纯化及其糖链结构鉴定

张琳，陈俊华，王小雪，马明兰，谭珺隽，刘阳

（武昌理工学院生命科学学院，湖北武汉430223）

南瓜糖蛋白的分离纯化及其糖链结构鉴定

张琳，陈俊华，王小雪，马明兰，谭珺隽，刘阳*

（武昌理工学院生命科学学院，湖北武汉430223）

采用水提醇沉法从南瓜粉中提取南瓜糖蛋白，分别用硫酸铵、乙醇分级沉淀及琼脂糖凝胶电泳法对南瓜糖蛋白进行分离纯化，定性检测后用碱性β-消除反应及核磁共振氢谱（Proton Nuclear Magnetic Resonance，1H NMR）、核磁共振碳谱（Carbon 13Nuclear Magnetic Resonance，13C NMR）技术测定糖肽键的结构。结果显示：纯化后的糖蛋白不含游离还原糖和淀粉，其在紫外240 nm附近南瓜糖蛋白碱水解液吸光度值发生了明显的变化，证明南瓜糖蛋白的糖肽键主要为O-糖肽键；其多糖的1H NMR和13C NMR谱图表明，该多糖组分的单糖残基中包含α-和β-两种糖苷键类型，且南瓜多糖主要含有3种端基碳分别为→4）-α-D-半乳糖-（1→、T-α-D-半乳糖-（1→和→2）-α-L-鼠李糖-（1→，在175.57和171.25处的共振吸收峰说明多糖中含有糖醛酸和脂类结构。

南瓜；糖蛋白；琼脂糖凝胶电泳；核磁共振

南瓜Cucurbita moschata（Duch.ex Lam.）Duch.ex Poiret）为葫芦科南瓜属植物。南瓜作为药食两用佳品，一直以来在临床上都是治疗糖尿病人的首选辅助食物[1]。根据临床实践证实，南瓜中的南瓜多糖是防治糖尿病的活性成分，它直接参与了降血糖、调血脂等相关活动[2]。熊学敏等[3]分析了南瓜多糖降血糖作用的机理，南瓜多糖可能是以糖蛋白的形式存在，并含有丰富的多种氨基酸，可刺激胰岛素分泌，产生降糖效果。糖蛋白是一类有糖类同多肽或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白，其结构中含有肽链、糖肽键和糖链，具有增强免疫调节、抑制肿瘤、降低血糖、血酯、抗氧化、防衰老等作用，在保健食品及新药开发方面具有较大的应用价值[4-5]。但是，到目前为止，有关南瓜糖蛋白的分离纯化及其结构研究罕见报道。对南瓜粉中糖蛋白进行了提取分离、纯化和结构鉴定研究，以期为后续南瓜糖蛋白降血糖作用的深入研究乃至产品开发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

南瓜粉：江苏顶能食物有限公司；氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇、偏重亚硫酸钠、活性炭、硫酸铵、蔗糖：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醚、盐酸高碘酸、氯仿：天津市天力化学试剂有限公司；琼脂糖：武汉市华顺生物技术有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒（D2500-50）：北京索莱宝生物科技有限公司。

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器、RE-201C旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司；PHSJ-4A雷磁实验室pH计：上海精密科学仪器有限公司；JY96-ⅡN超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；UPT-11-10T优普系列超纯水器：成都超纯科技有限公司；BS 224 S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；J-26XP Beckman高速冷冻离心机：贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；EPS-300稳压稳流电泳仪：上海天能科技有限公司；Bruker Avence300/600核磁共振仪：布鲁克（北京）科技有限公司；透析袋（分子截留量3000）：美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 南瓜糖蛋白的提取

称取180 g南瓜粉加入300 mL无水乙醚40℃水浴回流2 h，过滤，待残渣中的乙醚挥发后加1∶16的0.1 mol/L NaCl溶液，用磁力搅拌器搅拌均匀，再调节pH值为8.5，然后在60℃下超声辅助浸提50 min，浸提液于5 000 r/min离心10 min，取上清液（颜色为淡黄色）加入少量活性炭进行脱色，过滤得提取液并进行减压浓缩，调节pH值到南瓜粉蛋白质的等电点（pH= 4.2），再将其置4℃冰箱过夜，抽滤得沉淀，将其用无水乙醚洗涤3次[6]，即得粗品糖蛋白33.14 g。

1.2.2 南瓜糖蛋白的纯化

1.2.2.1 硫酸铵分级沉淀

取步骤1.2.1所得南瓜糖蛋白粗品30 g，溶于蒸馏水，配成5 g/100 mL溶液，过滤去除不溶物。滤液不断搅拌下缓慢加入硫酸铵至其浓度为35%，搅拌均匀。4℃冰箱静置12 h，5 000 r/min离心10 min，取上清液继续在搅拌条件下加硫酸铵至其浓度达75%，搅拌均匀。4℃冰箱静置过夜，离心得沉淀。

1.2.2.2 乙醇的分级沉淀

将步骤1.2.2.1所得沉淀全部溶解在蒸馏水中，配成溶液。在溶液中缓慢加入95%的乙醇至其浓度为45%，4℃冰箱静置12 h，5 000 r/min离心10 min得沉淀，45℃下干燥。得糖蛋白精品0.53 g。

1.2.3 南瓜糖蛋白的定性检测

采用碘－碘化钾反应、双缩脲反应、十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，CTAB）反应、斐林试剂检测对以上纯化所得精品糖蛋白（CMII）进行定性测定[7]。

1.2.4 南瓜糖蛋白的糖肽键的测定

称取纯化所获取的精品糖蛋白（CMII）0.5 g，配制成溶液，并经0.2 mol/L NaOH溶液2 h水解处理，用紫外可见分光光度计测得处理前和碱处理2.0 h后240 nm处吸光值。

1.2.5 南瓜糖蛋白的糖链的释放和脱蛋白质（肽链）

将蛋白碱水解样品与氯仿和正丁醇混匀，体积比为25∶4∶1，剧烈振荡20 min，5 000 r/min离心15 min，分为3层，由上到下为水层、蛋白层、有机层。取水层，按体积比为1∶9加入95%的乙醇，4℃冰箱静置12 h，离心得沉淀，加水溶解，用截留分子量为3000的透析袋去离子水中透析1 d，冷冻干燥得南瓜多糖（CMIII）0.132 g。

1.2.6 南瓜糖蛋白的糖链的纯化

1.2.6.1 南瓜糖蛋白（CMIII）糖链在电泳上定位

采用琼脂糖凝胶电泳，用pH=9.4的硼砂-NaOH的缓冲系统，电极缓冲液电压为50 V，电泳后割胶，于摇床（转速为85 r/min）上用高碘酸-Schiff试剂（PAS）染色，定位。首先用10%三氯乙酸（Trichloroacetic Acid，TCA）处理10 min，固定多糖的位置，蒸馏水反复洗3次后，加1%高碘酸进行氧化处理15 min，蒸馏水反复洗3次，接着加Schiff试剂进行室温避光染色30 min，用0.5%新配偏重亚硫酸钠洗胶3次（5 min/次），置于7%的醋酸溶液中保存，观察染色结果并且测定位移距离。（Schiff试剂的配制：称取1 g碱性品红，在200 mL沸水中溶解5 min，冷却至40℃～50℃，加入1.37 g偏重亚硫酸钠和20 mL 1 mo1/L HCl，冷却至室温，加入2匙活性炭搅拌直到溶液变成无色透明为止，过滤，4℃冰箱避光保存。）

1.2.6.2 电泳样品的回收

重复步骤1.2.6.1多次，在定位点进行割胶，用D2500-50试剂盒集中进行样品的回收，得样品（CMIV）。

1.2.7 南瓜多糖的核磁共振检测

样品（CMIV）溶解在D2O中形成浓度大约为30 mg/mL的溶液。所有的NMR试验都是在Bruker Avence300/600谱仪用5 mm[H-C-N]三共振探头测得。测试温度为室温25℃，所有脉冲前的弛豫等待时间为1.5 s，用DSS作为内标，测得样品1H NMR和13C NMR谱图。

2 结果与讨论

2.1 南瓜糖蛋白的定性检测

南瓜糖蛋白CMII的定性测定结果如表1所示。

表1 南瓜糖蛋白的定性检测Table 1 Qualitative detection of glycoprotein from pumpkin

由表1可知，双缩脲反应呈阳性表明所得南瓜糖蛋白（CMII）中含有蛋白质；CTAB反应呈阳性表明含有酸性多糖；而斐林试剂检测显示样品中不含游离多糖，碘-碘化钾反应呈阴性表明该糖蛋白制品中不含淀粉。综合检测结果可见，试验所得南瓜糖蛋白不含游离还原糖和淀粉，而为较纯的酸性糖蛋白。

2.2 南瓜糖蛋白的糖肽键的确定

将试验所得南瓜糖蛋白（CMII）0.53 g，配制成溶液，经NaOH溶液水解处理，用紫外可见分光光度计测得处理前和碱处理2.0 h后240 nm处吸光值，结果如表2。

能够构成O-糖肽键的氨基酸经过碱处理后在240 nm处存在特征吸收，由表2可知南瓜糖蛋白（CMII）水溶液经NaOH溶液处理后，在240 nm附近吸光度值发生了明显的变化，说明南瓜糖蛋白（CMII）中糖和蛋白是通过O-糖肽键连接的[8]。

表2 南瓜糖蛋白水解液紫外吸光值Table 2 The UV absorbance values of hydrolyzed glycoprotein from pumpkin

2.3 南瓜糖蛋白糖链结构的NMR测定

南瓜多糖的1H NMR谱图见图1。

图1 南瓜多糖（CMIV）的1H NMR谱图Fig.1 The1H NMR spectrum of pumpkin polysaccharide（CMIV）

在1H NMR图中，以DSS为基准物的基准峰化学位移在1.5左右，多糖的化学位移主要在δ 4.0～5.5范围之间。其中糖端基H信号集中在δ 4.8～5.5（2号峰）范围内，H2～H6上的质子信号主要在δ 4.0～4.8（1号峰）范围内。往往可以通过1H NMR谱图判定多糖残基构型[9]。通常来讲H1上的质子δ大于5.0为α型吡喃糖，而在H1上的质子δ小于5.0的是β型吡喃糖[10]。从图1中可以看出，南瓜多糖在H1质子信号区总共有4个吸收峰依次为4.86、5.08、5.32和5.50，说明该多糖组分的单糖残基中同时含α-和β-两种糖肽键的结构类型[12]。

南瓜多糖的13C NMR谱图见图2。

图2 南瓜多糖（CMIV）的13C NMR谱图Fig.2 The13C NMR spectrum of pumpkin polysaccharide（CMIV）

在13C NMR图中，以DSS为基准物的基准峰在化学位移在18左右，多糖的端基碳出峰主要集中在100处。从图2中可以看出，南瓜多糖端基碳C1的共振峰分别为99.4、99.7和100.4（3号峰），说明该组分主要含有3种单糖[12]，C2～C6的信号主要集中于δ68.58～79.15（2号峰）。通过文献查询，在171.3和175.6处的吸收峰分别是酯化的半乳糖醛酸的C=O和未酯化的C=O[13]（4号峰）。另查文献可知，图中100.4处C1吸收峰可能是T-α-D-半乳糖-（1→结构；而99.7处的C1吸收峰可能是→4）-α-D-半乳糖-（1[14]；果胶主链中的常见重复单元有→4）-α-D-半乳糖-（1→2）-α-L-鼠李糖-（1→结构，99.4处C1吸收峰可能是这个结构中的→2）-α-L-鼠李糖-（1→。13C谱图中的53.3吸收峰（1号峰）为酯化半乳糖醛酸中甲酯的特征吸收峰[15]。由于南瓜多糖的糖醛酸含量比较高，植物中的酸性多糖多为果胶类似物，所以结合多糖1H NMR和13C NMR推测南瓜多糖的结构也为果胶类似结构[16]。

3 结论

本文采用水提醇沉法和硫酸铵分级沉淀、Sevage法脱蛋白及琼脂糖凝胶电泳法对南瓜糖蛋白进行分离纯化，得到精品糖蛋白（CMII），通过定性检测，所得样品不含游离还原糖和淀粉，而为较纯的酸性糖蛋白。在240 nm紫外光附近南瓜糖蛋白的碱水解液吸光度值发生了明显的变化，南瓜糖蛋白的糖肽键主要为O-糖肽键。南瓜多糖的1H NMR和13C NMR谱图表明，该多糖组分的单糖残基中包含α-和β-两种糖苷键类型。且南瓜多糖主要含有3种端基碳，这3种端基碳的类型归属于→4）-α-D-半乳糖-（1→、T-α-D-半乳糖-（1→和→2）-α-L-鼠李糖-（1→。在175.6和171.3处的共振吸收峰说明多糖中含有糖醛酸和脂类结构。

4 讨论

糖蛋白结构的检测方法较多，主要有层析法、红外光谱法、质谱法、气相色谱法等。这些方法手续复杂，样品用量多，因而受到一定限制。采用快原子轰击和碰撞活化质谱法可推测糖基连接序列，但是不能确定各糖基或糖基与甙元相连接的位置；用红外光谱法测定糖链的苷键结构时，必须与质谱法联用。因此本文采用核磁共振法检测其糖链结构。此法不需要对样品进行化学降解或衍生化，操作简单、快速准确，且不需要其它对照品能够直接测定糖的连接顺序和连接位置，结果可靠；另外，天然产物的产率较低，核磁共振仪的检出限较其他波谱分析仪器高，因此核磁共振广泛用于天然产物的结构解析。本文采用核磁共振法对南瓜糖蛋白的结构进行检测分析，准确测定其糖肽键、苷键以及糖链结构，旨在为后续南瓜糖蛋白降血糖作用的深入研究提供试验依据。

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Separation，Purification and Sugar Chain Structural Identification of Pumpkin Glycoproteins

ZHANG Lin，CHEN Jun-hua，WANG Xiao-xue，MA Ming-lan，TAN Jun-jun，LIU Yang*
（School of Life Science，Wuchang University of Technology，Wuhan 430223，Hubei，China）

Pumpkin glycoproteins were extracted from pumpkin powder with water extraction and alcohol precipitation.The pumpkin glycoproteins were separated and purified in sequence with ammonium sulfate and ethanol precipitation and agarose gel electrophoresis.After qualitative investigation and alkaline β-elimination reaction，1H NMR and13C NMR were adopted to measure the structure of glycopeptide linkage.The experiments showed that：the purified glycoprotein did not contain the free reducing sugar and starch.In the spectrum near UV 240 nm，there was a significant change in the absorbance of the hydrolysate of the pumpkin glycoprotein，which proved that the glycopeptide linkage was mainly O-glycopeptide.Meanwhile，the1H NMR and13C NMR spectrogram of its polysaccharide showed that the monosaccharide residue of the polysaccharide contained both α-and β-glycoside bond types，while polysaccharides mainly contained three anomeric carbon which were→4）-α-D-GalpA-（1→，T-α-D-Galp-（1→and→2）-α-L-Rhap-（1→，at175.57 and 171.25，the resonance-absorption peak indicates the polysaccharides contains uronic acid and lipid structure.

pumpkin；glycoprotein；agarose gel electrophoresis；nuclear magnetic resonance（NMR）

2016-11-24

张琳（1986—），女（汉），助教，硕士，研究方向：天然药物生物活性物质基础。

*通信作者：刘阳，女，副教授，研究方向：天然药物生物活性物质基础。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.014