胃癌组织中MGMT基因甲基化与DNMT1蛋白表达的关系

刘山秀 姜相君

青岛大学医学院附属青岛市市立医院消化内二科(266000)



胃癌组织中MGMT基因甲基化与DNMT1蛋白表达的关系

刘山秀 姜相君*

青岛大学医学院附属青岛市市立医院消化内二科(266000)

背景：研究表明MGMT基因启动子区甲基化与包括胃癌在内的多种恶性肿瘤密切相关。DNA甲基转移酶1(DNMT1)在多种肿瘤组织中的表达上调。但目前关于胃癌组织中MGMT基因甲基化状态与DNMT1表达关系的研究少见。目的：探讨MGMT基因甲基化、DNMT1蛋白表达与胃癌的关系。方法：采用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测60例胃腺癌组织及其相应癌旁组织中MGMT基因启动子区甲基化状态，RT-PCR、免疫组化法分别检测MGMT、DNMT1 mRNA和蛋白表达。结果：胃癌组织中MGMT基因启动子区甲基化率明显高于癌旁组织(45.0%对13.3%，P<0.001)。胃癌组织中MGMT mRNA阳性表达率显著低于癌旁组织(41.7%对93.3%，P<0.001)，而DNMT1 mRNA阳性率明显升高(76.7%对18.3%，P<0.001)。MGMT mRNA阴性表达的胃癌组织中其基因启动子甲基化率较阳性表达者升高(57.1%对28.0%，P<0.05)。胃癌组织中MGMT蛋白表达与DNMT1蛋白表达呈负相关(r=-0.795，P<0.01)。结论：MGMT基因启动子区高甲基化和DNMT1高表达可能与胃癌的发生、发展有关。DNMT1可能调控MGMT基因的甲基化过程。

胃肿瘤； O(6)-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶； 甲基化； DNMT1

胃癌的发生、发展是遗传、环境等多种因素参与的复杂过程，涉及遗传学和表观遗传等方面，甲基化作为基因表观遗传学的一部分，受到越来越多的关注。DNA甲基转移酶1(DNMT1)在基因甲基化过程中起主要的维持甲基化状态的作用[1]。6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)是一种DNA修复酶，可修复烷化剂所致的DNA损伤，从而起抑制癌症发生的作用[2]。有研究表明MGMT基因甲基化与结直肠癌[3]、非小细胞肺癌[4]、神经胶质瘤[5]有关。Yousuf等[6]发现MGMT基因高甲基化与胃癌的发生有关。但目前关于胃癌组织中MGMT基因甲基化状态与DNMT1表达关系的研究少见。本实验通过分析胃腺癌组织中MGMT基因启动子区甲基化状态以及MGMT、DNMT1 mRNA和蛋白表达，旨在探讨其与胃癌发生、发展的关系。

材料与方法

一、组织来源

收集2015年1月—2016年7月青岛大学医学院附属青岛市市立医院普外科切除的胃癌标本共60例(其中男35例，女25例，年龄39～73岁，中位年龄56岁)，经组织学检查证实为原发性胃腺癌，术前均未行放化疗。胃癌组织取自癌灶中央非坏死区域，癌旁组织距癌组织5 cm以上，所有标本液氮速冻后-80 ℃保存。本研究方案经青岛大学临床学院伦理委员会批准，研究对象均取得知情同意。

二、主要试剂

基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]，DNA甲基化试剂盒(Zymo Research Corp)，RT-PCR反应试剂盒、Trizol抽提试剂(日本TaKaRa公司)，免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

三、研究方法

1. 组织DNA的提取和甲基化修饰：取30 mg组织，提取基因组DNA。取DNA 800 ng，根据EZ DNA甲基化试剂盒说明书进行操作，修饰好的DNA洗脱后-20 ℃保存。

2. 引物设计：根据MGMT基因启动子区CpG岛序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司设计引物序列。甲基化引物上游：5’-TTT CGA CGT TCG TAG GTT TTC GC-3’；下游：5’-GCA CTC TTC CGA AAA CGA AAC G-3’；非甲基化引物上游：5’-TTT GTG TTT TGA TGT TTG TAG GTT TTT GT-3’，下游：5’-AAC TCC ACA CTC TTC CAA AAA CAA AACA-3’[7]。

3. MSP：反应体系包含PCR混合液12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、2 μL修饰后的DNA，以灭菌双蒸水补足至25 μL。反应条件：97 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，57 ℃(甲基化引物)、55 ℃(非甲基化引物)退火60 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μL产物行2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外光照射下观察并分析。

4. RT-PCR法：Trizol抽提组织RNA，逆转录合成cDNA，行PCR反应。MGMT上游引物：5’-GGA AGC TGC TGA AGG TTG TG-3’，下游：5’-GCT GCT GCA GAC CAC TCT GT-3’；DNMT1上游引物：5’-CGG TTC TTC CTC CTG GAG AAT GTC A-3’，下游：5’-CAC TGA TAG CCC ATG CGG ACC A-3’；以β-actin作为内参，上游引物：5’-CTG CTC GCT TCG CTA CTT GCA-3’，下游：5’-CGG CAC CTG TCC TAC GAG TTG-3’；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系为20 μL，内含SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)10.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye(×50)0.4 μL，灭菌蒸馏水6.0 μL。PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；72 ℃ 7 min。上ABI 7300 Real-time PCR仪实时检测，采用2-ΔΔCt法分析结果，将Ct值<30视为阳性表达。

5. 免疫组化染色：3% H2O2室温孵育15 min消除内源性过氧化物酶活性，抗原热修复。加入一抗(工作浓度1∶100)4 ℃室温孵育12 h，PBS冲洗，加入二抗(浓度1∶100)37 ℃孵育30 min，PBS冲洗。DAB染色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜下观察。PBS代替一抗作为阴性对照，取已知阳性切片在同一条件下染色作为阳性对照。

结果判定：MGMT蛋白主要分布于细胞质，少量表达于细胞核；DNMT1主要分布于胞核，少量表达于胞质。随机选取5个高倍视野观察细胞染色情况。阳性细胞比例：0分，阳性细胞数占总细胞数的比例≤5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，>75%。染色强度：0分，未着色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，褐色。以阳性细胞比例与染色强度之积作为染色总评分，评分为0～4分者视为阴性表达，5～12分为阳性表达。

四、统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件，计量资料组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，两种蛋白表达的相关性分析采用Spearman相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

《红高粱家族》是莫言的代表作，小说中莫言用野性的眼光将具有鲜活生命力的主体融入历史，运用极具感官性的文字展示了人物最真实、完整的一面。小说主要讲述了生长在中国高密东北乡的有着原始、粗犷、豪放个性的生命演绎了一场轰轰烈烈的爱情与抗战之歌。文中处处彰显了作者对鲜活的生命力的肯定、赞美和呼唤，突出了主要人物强烈的生命意识与不屈不挠的民族抗争精神。

结 果

一、胃癌组织中MGMT启动子区甲基化情况

胃癌组织中MGMT基因启动子区甲基化率为45.0%(27/60)，明显高于癌旁组织(13.3%，8/60)，差异有统计学意义(χ2=14.56，P<0.001)(图1)。

MP：甲基化阳性对照；ddH2O：阴性对照；N：癌旁组织；T：胃腺癌组织；M：甲基化条带；U：非甲基化条带

图1 胃癌组织中MGMT基因甲基化状态(MSP法)

二、胃癌组织中MGMT、DNMT1 mRNA表达

MGMT mRNA在胃癌组织中表达率为41.7%(25/60)，癌旁组织中为93.3%(56/60)，组间相比差异有统计学意义(χ2=36.51，P<0.001)；胃癌组织中DNMT1 mRNA表达率为76.7%(46/60)，明显高于癌旁组织(18.3%，11/60)，差异有统计学意义(χ2=40.94，P<0.001)。MGMT mRNA阴性表达的胃癌组织DNMT1 mRNA阳性表达率(91.4%，32/35)明显高于MGMT mRNA阳性表达者(56.0%，14/25)，差异有统计学意义(χ2=10.23，P<0.05)。

三、胃癌组织中MGMT、DNMT1蛋白表达情况

MGMT蛋白主要表达于细胞质，细胞核少量表达(图2)，其在胃癌组织中的表达阳性率(40.0%，24/60)明显低于癌旁组织(93.3%，56/60)，差异有统计学意义(χ2=38.40，P<0.001)。DNMT1主要表达于细胞核，细胞质中少量表达(图3)，其在胃癌组织中的表达阳性率(76.7%，46/60)明显高于癌旁组织(6.7%，4/60)，差异有统计学意义(χ2=60.48，P<0.001)。

四、胃癌组织中MGMT基因甲基化与MGMT mRNA表达的关系

MGMT mRNA阴性表达的胃癌组织中MGMT基因启动子区甲基化率(57.1%，20/35)显著高于MGMT mRNA阳性表达的胃癌组织(28.0%，7/25)，差异有统计学意义(χ2=11.96，P<0.05)。

五、胃癌组织中MGMT与DNMT1蛋白表达的相关性

胃癌组织中MGMT蛋白表达与DNMT1蛋白表达呈负相关(r=-0.795，P<0.01)。

图2 MGMT在胃癌组织和癌旁组织中的表达(免疫组化染色，×400)

A：胃癌组织；B：癌旁组织

图3 DNMT1在胃癌组织和癌旁组织中的表达(免疫组化染色，×400)

讨 论

胃癌的全球发病率在恶性肿瘤中位居第五位，死亡率更高居第三位，我国每年胃癌新发病例占全球新发病例的2/5以上[8]。胃癌的发生、发展是多种复杂因素参与的过程，其中涉及遗传学和表观遗传学等多种机制。DNA甲基化是指以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基供体，在DNMT的催化下，将其甲基转移至氧胞嘧啶环的第5位碳原子从而形成甲基化脱氧胞嘧啶(5mC)的修饰作用[9]，抑癌基因CpG岛甲基化可导致其沉默。烷化剂是一种在环境中普遍存在的致癌物质，能使DNA鸟嘌呤的O6位发生烷基化，形成O6-甲基鸟嘌呤，导致胸腺嘌呤和鸟嘌呤错配，从而改变基因的表观遗传性，引起癌症的发生。

MGMT定位于染色体10q26，全长约170 kp[10]，可将烷化剂作用所形成的加合物从DNA上移除，使机体细胞免受烷化剂的损伤，起保持基因组完整性的作用。MGMT异常与肿瘤的发生和进展关系密切，大量研究显示MGMT在多种肿瘤中的表达明显降低，如胶质瘤、淋巴瘤、头颈部肿瘤、非小细胞肺癌等[11]。本实验采用MSP技术检测胃癌组织及其相应癌旁组织中MGMT基因启动子区甲基化状态，同时应用RT-PCR、免疫组化法分别检测MGMT mRNA和蛋白表达，结果显示胃癌组织中MGMT基因启动子区甲基化率较相应癌旁组织明显升高，而MGMT mRNA、蛋白表达率较癌旁组织明显降低，说明胃癌组织中MGMT蛋白表达降低可能与该基因启动子区甲基化有关系。

目前有研究认为DNA启动子区甲基化是部分可逆的，而DNA甲基化需DNMT的催化，DNMT包括DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等。有研究结果显示DNMT1在多种癌组织中表达增高，如肾透明细胞癌[12]、前列腺癌[13]等。本实验显示DNMT1在胃癌组织中的表达率明显高于癌旁组织，与本课题组之前的研究[14-15]结果相一致。

本研究发现，MGMT mRNA阴性表达的胃癌组织中MGMT基因甲基化率较MGMT mRNA阳性表达者升高。综合以上结果，初步推测组织中DNMT1蛋白表达增高，使DNA修复酶MGMT基因发生高甲基化，表达缺失或减少，从而导致组织癌变。但具体调节机制还需大样本实验进一步证实。

总之，虽然数十年来恶性肿瘤检测技术取得不断突破，但胃癌的发病率和死亡率仍非常高。早期诊断和治疗对提高胃癌患者的生活质量和预后具有重要意义。本研究立足于表观遗传学水平，发现MGMT基因启动子区CpG岛高甲基化和DNMT1高表达可能与胃癌的发生、发展有关，DNMT1可能调控MGMT基因的甲基化过程，从而为胃癌的早期诊治提供新思路。

1 Fukagawa A, Ishii H, Miyazawa K, et al. δEF1 associates with DNMT1 and maintains DNA methylation of the E-cadherin promoter in breast cancer cells[J]. Cancer Med, 2015, 4 (1): 125-135.

2 Ishikawa T, Zhang SS, Qin X, et al. DNA repair and cancer: lessons from mutant mouse models[J]. Cancer Sci, 2004, 95 (2): 112-117.

3 Fornaro L, Vivaldi C, Caparello C, et al. Pharmacoepig-enetics in gastrointestinal tumors: MGMT methylation and beyond[J]. Front Biosci (Elite Ed), 2016, 8: 170-180.

4 Gu C, Lu J, Cui T, et al. Association between MGMT promoter methylation and non-small cell lung cancer: a meta-analysis[J]. PLoS One, 2013, 8 (9): e72633.

5 Mur P, Rodríguez de Lope, Díaz-Crespo FJ, et al. Impact on prognosis of the regional distribution of MGMT methylation with respect to the CpG island methylator phenotype and age in glioma patients[J]. J Neurooncol, 2015, 122 (3): 441-450.

6 Yousuf A, Bhat MY, Pandith AA, et al. MGMT gene silencing by promoter hypermethylation in gastric cancer in a high incidence area[J]. Cell Oncol (Dordr), 2014, 37 (4): 245-252.

7 Bae SI, Lee HS, Kim SH, et al. Inactivation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter CpG island hypermethylation in gastric cancers[J]. Br J Cancer, 2002, 86 (12): 1888-1892.

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11 Pasini A, Paganelli G, Tesei A, et al. Specific Biomarkers Are Associated with Docetaxeland Gemcitabine-Resistant NSCLC Cell Lines[J]. Transl Oncol, 2012, 5 (6): 461-468.

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13 Zhang W, Jiao H, Zhang X, et al. Correlation between the expression of DNMT1, and GSTP1 and APC, and the methylation status of GSTP1 and APC in association with their clinical significance in prostate cancer[J]. Mol Med Rep, 2015, 12 (1): 141-146.

14 姜相君, 初蕾蕾, 崔艳欣, 等. Runx3、Rassf1a基因启动子在胃癌组织中的高甲基化及Dnmt1的表达[J]. 世界华人消化杂志, 2012, 20 (35): 3457-3463.

15 张杰, 张梅, 姜相君. 胃癌组织中ERCC1基因的高甲基化及DNMT1的表达[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2016, 25 (6): 626-629.

(2017-01-09收稿；2017-02-12修回)

Relationship between Methylation of MGMT Gene and Protein Expression of DNMT1 in Gastric Cancer

LIU Shanxiu, JIANG Xiangjun.

Department of Gastroenterology Ⅱ, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao University Medical College, Qingdao, Shandong Province (266000)

JIANG Xiangjun, Email: drjxj@163.com

Stomach Neoplasms; O(6)-Methylguanine-DNA Methyltransferase; Methylation; DNMT1

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.07.005

*本文通信作者，Email: drjxj@163.com

Background: Studies have shown that promoter methylation of MGMT gene is closely related to many malignant tumor including gastric cancer. DNA methyltransferase 1 (DNMT1) is highly expressed in many malignant tumor tissues. However, studies on relationship between methylation of MGMT gene and DNMT1 expression in gastric cancer are rare. Aims: To investigate the relationship between methylation of MGMT gene, protein expression of DNMT1 and gastric cancer. Methods: Promoter methylation status of MGMT gene in 60 gastric adenocarcinoma tissues and corresponding paracancerous tissues were detected by methylation-specific PCR (MSP). RT-PCR and immunohistochemistry were used to measure mRNA and protein expressions of MGMT and DNMT1, respectively. Results: Methylation rate of MGMT gene promoter in gastric cancer was significantly higher than that in paracancerous tissue (45.0%vs. 13.3%,P<0.001). The positivity rate of MGMT mRNA in gastric cancer was significantly lower than that in paracancerous tissue (41.7%vs. 93.3%,P<0.001), while the positivity rate of DNMT1 mRNA expression in gastric cancer was significantly higher than that in paracancerous tissue (76.7%vs. 18.3%,P<0.001). Methylation rate of MGMT promoter in MGMT mRNA-negative expressed gastric cancer tissue was significantly higher than that in MGMT mRNA-positive expressed gastric cancer tissue (57.1%vs. 28.0%,P<0.05). It showed a negative correlation between MGMT protein expression and DNMT1 protein expression in gastric cancer tissue (r=-0.795,P<0.01). Conclusions: Promoter methylation of MGMT gene and high expression of DNMT1 may be associated with the development and progression of gastric cancer.