赖氨酸二肽对奶牛乳腺mTOR信号通路元件基因表达的影响

周苗苗，崔景香

(山东潍坊科技学院 动物科学研究所，山东寿光 262700)



赖氨酸二肽对奶牛乳腺mTOR信号通路元件基因表达的影响

周苗苗，崔景香

(山东潍坊科技学院 动物科学研究所，山东寿光 262700)

为研究赖氨酸二肽对奶牛乳腺组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响，在体外培养的奶牛乳腺组织培养液中分别添加赖氨酸-赖氨酸、赖氨酸-亮氨酸和赖氨酸-组氨酸二肽，等量取代培养液中φ=5%、5%和15%的游离赖氨酸(赖氨酸总质量浓度为210 mg/L)；在此基础上，在赖氨酸组和赖氨酸-赖氨酸二肽5%取代组分别添加终浓度为0和100 nmol/L的mTOR抑制剂雷帕霉素。试验结束后收集乳腺组织用于αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1的基因表达检测。结果发现，与游离氨基酸相比，添加3种赖氨酸二肽显著增加αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因的表达；添加雷帕霉素抑制上述基因的表达，赖氨酸-赖氨酸二肽可以降低雷帕霉素的抑制作用。结果表明，除作为合成底物外，赖氨酸二肽还可能通过调控mTOR信号通路促进乳蛋白的合成。

赖氨酸二肽；αs1酪蛋白；mTOR；奶牛乳腺组织

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路能感受来自营养素、胰岛素和生长因子、能量及压力信号控制细胞生长[1]。mTOR作为真核生物细胞内信号网络的组成部分发挥着显著而广泛的作用。氨基酸是奶牛乳蛋白合成的前体物质。除作为营养元素外，氨基酸也可作为信号分子通过mTOR信号通路来调节mRNA的翻译起始，进而调控乳蛋白的合成[2-3]。已有研究[4-5]表明，除氨基酸外，奶牛乳腺组织也摄取血液循环中的小肽(2～3个氨基酸组成)用于合成乳蛋白。为探讨小肽除作为乳蛋白合成前体物质之外的其他可能作用，本试验研究赖氨酸(lysine, Lys)二肽对体外培养奶牛乳腺组织的乳蛋白合成和mTOR信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 奶牛乳腺组织的制备和体外培养

采集3头泌乳中后期的中国荷斯坦奶牛乳腺组织，清洗并剪碎至1 mm3大小，种植于6孔细胞板孔(Corning, USA)，于37 ℃,φ=5%二氧化碳培养箱中培养。当组织块稳定贴壁后，每孔添加2 mL培养液[6]。培养液组成为：基础培养液DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)-F12 (Gibco, USA)、10 g/L谷氨酰胺、100 000 IU/L青霉素、100 mg/L链霉素、5 mg/L 胰岛素、500 μg/L催乳素、1 mg/L氢化可的松和φ=10%的胎牛血清(fetal calf serum, FCS，杭州四季青生物工程材料有限公司)。

1.2 试验设计

去除乳腺组织培养液中的胎牛血清，分别添加氨基酸、苯丙氨酸(phenylalanine, Phe) 117 mg/L、苏氨酸(threonine, Thr) 135 mg/L、蛋氨酸(methionine, Met) 60 mg/L、Lys 210 mg/L、亮氨酸(leucine, Leu) 214 mg/L、异亮氨酸(isoleucine, Ile) 120 mg/L、缬氨酸(valine, Val) 154 mg/L、组氨酸(histidine, His) 45 mg/L。然后按如下方案进行试验设计。

1.2.1 Lys二肽等量替代游离Lys 分别以Lys总量(210 mg/L)φ=5%的Lys-Leu、φ=5%的Lys-Lys以及φ=15%的Lys-His替代乳腺组织培养液中等量的Lys(表1)。为保持各氨基酸总质量浓度(肽结合氨基酸+游离氨基酸)不变，相应调整各处理组Lys、His和Leu的添加量。培养48 h后，分别收集乳腺组织用于总RNA提取。每个处理重复3次。

表1 Lys二肽等量替代游离LysTable 1 Equivalent replacement of free lysine by lysine dipeptide

1.2.2 不同剂量雷帕霉素的添加 在游离Lys组和Lys-Lysφ=5%等量替代组培养液中分别添加雷帕霉素(Sigma, USA)，使其终浓度分别为0和100 nmol/L(表2)，乳腺组织培养48 h后，分别收集用于总RNA提取。每个处理重复3次。

表2 不同剂量雷帕霉素的添加Table 2 Addition of different dose of rapamycin

1.3 基因mRNA丰度检测

用Trizol (Invitrogen, USA)提取组织中的总RNA。以紫外吸光法检测RNA纯度(OD260nm/OD280nm>1.80)。抽提的RNA溶解后立即用于第一链cDNA的合成。反转录在0.2 mL PCR管中进行，反应体系为10 μL：2 μL PrimeScriptTMBuffer (5×)、0.5 μL PrimeScriptTMRT、0.5 μL Oligo (dT) primer (25 μmol/L)、0.5 μL Random 6 mer (50 μmol/L; Takara, 大连)和6.5 μL RNA (500 ng)；反应条件为37 ℃ 15 min。然后于85 ℃孵育5 s终止反应。合成的cDNA贮存于-20 ℃，备用。

用实时荧光定量PCR方法检测αs1酪蛋白、mTOR、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1 (eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1， 4E-BP1)、S6激酶1 (S6 kinase 1， S6K1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA丰度。所用引物信息见表3。PCR反应在96孔板中进行，20 μL反应体系包括：SYBR○RPremix ExTaqTM(2×) 10.0 μL [Takara, 宝生物工程(大连)有限公司]、PCR正向引物(10 μmol/L) 0.4 μL、PCR反向引物(10 μmol/L) 0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.4 μL (Takara, 宝生物工程(大连)有限公司)、纯水6.8 μL和cDNA 2 μL。用纯水替代cDNA模板作为阴性对照。ABI 7500实时定量序列检测软件(Applied Biosystems, USA)自动读取Ct值。所有被测基因的扩增效率均在100%～105%。采用2-△△Ct方法计算每个目的基因 mRNA的相对表达量。

表3 实时荧光定量引物信息Table 3 Primer information used in real-time PCR

1.4 统计分析

所有数据用Excel软件处理，用SAS软件PROC-GLM程序统计分析。

2 结果与分析

2.1 赖氨酸二肽对αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因表达的影响

在培养液中添加赖氨酸二肽可以影响奶牛乳腺组织中αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1的基因表达(图1)。同游离Lys组相比，Lys-Leu、Lys-Lys和Lys-His二肽组αs1酪蛋白、mTOR和 4E-BP1的mRNA表达均显著提高(P<0.05)；Lys-Lys和Lys-His的添加促进 S6K1的基因表达(P<0.05)。

2.2 雷帕霉素对αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因表达的影响

添加mTOR抑制剂雷帕霉素能显著抑制游离Lys组奶牛乳腺组织αs1酪蛋白基因的表达(P<0.05，图2)。与不添加雷帕霉素的Lys-Lys组相比，雷帕霉素(终浓度100 nmol/L)降低Lys-Lys组奶牛乳腺组织αs1酪蛋白mRNA的表达丰度，但差异不显著(图2)。不添加和添加终浓度为100 nmol/L的雷帕霉素时，Lys-Lys组奶牛乳腺组织αs1酪蛋白mRNA表达丰度均高于Lys组(P<0.05，图2)。

图中柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同 Bars with different lowercase letters are statistically different (P<0.05),the same below
图1 不同赖氨酸二肽处理的基因表达
Fig.1 Gene expression under different peptide-bound Lys

图2 不同浓度雷帕霉素处理的αs1酪蛋白基因表达Fig.2 αs1 casein gene expression under different concentration of rapamycin

添加雷帕霉素能显著抑制游离Lys组和Lys-Lys组奶牛乳腺组织mTOR基因的表达(P<0.05，图3)。不添加和添加终浓度为100 nmol/L的雷帕霉素时，Lys-Lys组奶牛乳腺组织mTORmRNA表达丰度均高于Lys组(P<0.05，图3)。

添加雷帕霉素能显著抑制游离Lys组和Lys-Lys组奶牛乳腺组织 4E-BP1基因表达(P<0.05，图4)。不添加雷帕霉素时，Lys-Lys组奶牛乳腺组织 4E-BP1 mRNA表达丰度显著高于Lys组(P<0.05，图4)。当添加终浓度为100 nmol/L 的雷帕霉素时，Lys-Lys组 4E-BP1 mRNA表达丰度虽高于Lys组，但差异不显著(图4)。

图3 不同浓度雷帕霉素处理的mTOR基因表达Fig.3 mTOR gene expression under different concentration of rapamycin

图4 不同浓度雷帕霉素处理的 4E-BP1基因表达Fig.4 4E-BP1 gene expression under different concentration of rapamycin

添加雷帕霉素能显著抑制游离Lys组和Lys-Lys组奶牛乳腺组织 S6K1基因表达(P<0.05，图5)。不添加雷帕霉素时，Lys-Lys组奶牛乳腺组织 S6K1 mRNA表达丰度显著高于Lys组(P<0.05，图5)。添加终浓度为100 nmol/L的雷帕霉素时，Lys-Lys组 S6K1 mRNA表达丰度高于Lys组，但差异不显著(图5)。

图5 不同浓度雷帕霉素处理的 S6K1基因表达Fig.5 S6K1 gene expression under different concentration of rapamycin

3 讨 论

3.1 赖氨酸二肽对αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因表达的影响

氨基酸可以作为信号分子通过活化蛋白激酶mTOR调控 4E-BP1和 S6K1等蛋白的磷酸化进而参与乳蛋白的合成调控[7]。Moshel等[2]利用体外培养的泌乳乳腺上皮细胞模型研究氨基酸对翻译过程的调控作用。结果发现，氨基酸经由mTOR信号途径调控乳腺上皮细胞中乳蛋白的合成速率。Prizant等[3]研究体外培养的泌乳鼠乳腺上皮细胞中必需氨基酸通过mTOR通路在蛋白合成中的作用。结果发现，来自于氨基酸的正负调控信号通过mTOR信号传导通路联合胰岛素调控来调节总蛋白和乳腺上皮细胞中特殊乳蛋白的合成速率。同样，小肽也能作为信号分子发挥作用。在中枢神经系统中有很多诸如L-京都啡肽(L-Tyr-L-Arg)、肌肽(β-Ala-His)、Cys-Gly、Gly-Gln和N-乙酰-Asp-Glu等的神经小肽发挥重要作用[8]。因此，小肽极有可能在乳腺中作为信号分子通过mTOR信号途径调节乳蛋白的合成。本试验结果表明，在培养液中添加3种赖氨酸二肽均显著促进奶牛乳腺组织中αs1酪蛋白基因的表达(P<0.05)；Lys二肽亦可影响mTOR信号通路中3种主要效应元件mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因的表达。与游离Lys组相比，Lys-Leu、Lys-Lys和Lys-His二肽均显著提高mTOR和 4E-BP1 mRNA的表达丰度(P<0.05)；Lys-Lys和Lys-His则促进 S6K1基因的表达(P<0.05)。结果提示，同氨基酸一样，某些Lys二肽也可能通过mTOR信号途径参与对乳蛋白合成调控。

3.2 雷帕霉素对αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因表达的影响

哺乳动物TOR联合调节蛋白(Raptor)对维持mTOR活性来说是必需的，它对mTOR活性发挥正调控作用[9]。雷帕霉素是mTOR的功能抑制剂，它可以干扰mTOR-Raptor的交互作用，进而阻止mTOR活化S6K和4E-BP[9-11]。为进一步研究小肽对mTOR信号通路的影响，试验选择在游离Lys组和Lys-Lys 5%等量替代组培养液中分别添加终浓度为0和100 nmol/L的雷帕霉素。结果发现，雷帕霉素显著抑制游离Lys组奶牛乳腺组织αs1酪蛋白基因的表达(P<0.05)，但对Lys-Lys组αs1酪蛋白mRNA表达丰度没有显著影响。这说明雷帕霉素的添加抑制乳腺组织中乳蛋白的合成，而Lys-Lys的添加则降低这种抑制作用。添加雷帕霉素显著抑制游离Lys组和Lys-Lys组奶牛乳腺组织mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因的表达(P<0.05)。与Lys相比，Lys-Lys的添加促进雷帕霉素处理组奶牛乳腺组织mTOR基因的表达(P<0.05)，提高雷帕霉素处理组 4E-BP1和 S6K1 mRNA的表达丰度。这些结果表明雷帕霉素抑制乳腺组织中mTOR信号通路中3种作用元件基因的表达，Lys-Lys的添加则降低这种抑制作用。综上所述，雷帕霉素通过降低mTOR、 4E-BP1和 S6K1的活性进而抑制αs1酪蛋白的合成，Lys-Lys的添加则降低这种抑制作用。由此推测，与氨基酸一样，Lys-Lys二肽很有可能作为信号分子通过激活mTOR信号通路，降低雷帕霉素对mTOR信号通路以及乳蛋白合成的抑制作用。

4 结 论

本研究发现，在培养液中添加Lys-His、Lys-Lys和Lys-Leu 3种二肽均可显著促进奶牛乳腺组织中αs1酪蛋白、mTOR和 4E-BP1基因的表达，Lys-Lys和Lys-His则促进 S6K1基因的表达；雷帕霉素能抑制mTOR、 4E-BP1、 S6K1和αs1酪蛋白基因的表达，Lys-Lys的添加则降低这种抑制作用，提示Lys二肽可能作为信号分子通过mTOR信号途径参与乳蛋白合成调控。

Reference：

[1] AVRUCH J,LONG X,ORTIZ-VEGA S,etal.Amino acid regulation of TOR complex 1 [J].AmericanJournalofPhysiology-EndocrinologyandMetabolism,2009,296(4):592-602.

[2] MOSHEL Y,RHOADS R E,BARASH I.Role of amino acids in translational mechanisms governing milk protein synthesis in murine and ruminant mammary epithelial cells [J].JournalofCellularBiochemistry,2006,98(3):685-700.

[3] PRIZANT R L,BARASH I.Negative effects of the amino acids Lys,His,and Thr on S6K1 phosphorylation in mammary epithelial cells [J].JournalofCellularBiochemistry,2008,105(4):1038-1047.

[4] ZHOU M M,WU Y M,LIU H Y,etal.Effects of phenylalanine and threonine oligopeptides on milk protein synthesis in cultured bovine mammary epithelial cells [J].JournalofAnimalPhysiologyandAnimalNutrition,2015,99(2):215-220.

[5] 周苗苗,崔景香.含赖氨酸二肽对奶牛乳蛋白合成和乳腺氨基酸转运相关基因表达的影响[J].中国畜牧兽医,2016,43(5):1156-1161.

ZHOU M M,CUI J X.Effects of lysine dipeptides on gene expression of milk protein and amino acid transporters in bovine mammary gland explants [J].ChinaAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,2016,43(5):1156-1161(in Chinese with English abstract).

[6] 周苗苗,崔景香.泌乳相关激素及苏氨酸和苯丙氨酸比例对乳蛋白合成的影响[J].西北农业学报,2016,25(2):159-165.

ZHOU M M,CUI J X.Effects of lactogenic hormones and ratio of threonine to phenylalanine on milk protein synthesis in cultured bovine mammary gland [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2016,25(2):159-165 (in Chinese with English abstract).

[7] 余 婕,晏向华.氨基酸调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1信号通路的分子机制[J].动物营养学报,2015,27(7):2012-2017.

YU J,YAN X H.Molecular mechanism of amino acids in regulation of mammalian target of rapamycin complex 1 signaling pathway [J].ChineseJournalofAnimalNutrition,2015,27(7):2012-2017 (in Chinese with English abstract).

[8] THAKKAR S V,MIYAUCHI S,PRASAD P D,etal.Stimulation of Na+/Cl--coupled opioid peptide transport system in SK-N-SH cells by L-kyotorphin,an endogenous substrate for H+-coupled peptide transporter PEPT2 [J].DrugMetabolismandPharmacokinetics,2008,23(4):254-262.[9] HAY N,SONENBERG N.Upstream and downstream of mTOR [J].GenesandDevelopment,2004,18(16):1926-1945.

[10] KIM D H,SARBASSOV D D,ALI S M,etal.mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery [J].Cell,2002,110(2):163-175.

[11] OSHIRO N,YOSHINO K,HIDAYAT S,etal.Dissociation of raptor from mTOR is a mechanism of rapamycin-induced inhibition of mTOR function [J].GenesCells,2004,9(4):359-366.

(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Effects of Lysine Dipeptides on Gene Expression of mTOR Signal Pathway Elements in Gland Explants of Bovine Mammary .

ZHOU Miaomiao and CUI Jingxiang.

(Institute of Animal Science,Weifang University of Science and Technology,Shouguang Shandong 262700,China)

The study was to investigate the effects of lysine (Lys) dipeptides on gene expression of mammalian target of rapamycin (mTOR) signal pathway elements in gland explants of bovine mammary . Mammary gland tissues were obtained from Chinese Holstein dairy cows and cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium-F12 with the lactogenic hormones (prolactin, hydrocortisone and insulin). Firstly, the free Lys in culture medium was equivalent substituted with Lys-Lys, Lys-leucine (Leu), Lys-histidine (His) at ratio ofφ=5%, 5%, 10%, respectively. Then, rapamycin, the mTOR inhibitor, was added in the Lys group and Lys-Lys group at concentration of 0 and 100 nmol/L, respectively. After 48 h , mammary gland tissues were harvested for casein alpha s1,mTOR, 4E-BP1 and S6K1 gene expression analysis by real-time PCR. The Lys dipeptides significantly enhanced the gene expression of casein alpha s1,mTOR, 4E-BP1 and compared S6K1 with equivalent free Lys. The addition of rapamycin inhibited the gene expression of casein alpha s1,mTOR, 4E-BP1 and S6K1, and Lys-Lys dipeptide decreased the inhibitory effect. The results indicated that, as the synthetic substrates, the Lys dipeptides may also promote the synthesis of milk protein by modulating the mTOR signal pathway.

Lysine dipeptides; Casein alpha s1; Mammalian target of rapamycin; Bovine mammary gland explant

2016-04-18 Returned 2016-05-30

Project of Weifang Science and Technology Development (No.2015GX077).

ZHOU Miaomiao, female, Ph.D,associate professor. Research area:ruminant nutrition. E-mail: zhoumm0329@163.com

日期：2017-06-29

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1107.010.html

2016-04-18

2016-05-30

潍坊市科技发展计划(2015GX077)。

周苗苗，女，博士，副教授，主要从事反刍动物营养研究。E-mail:zhoumm0329@163.com

S823

A

1004-1389(2017)07-0963-05