光合作用合成相关差异蛋白对应基因在高油酸油菜近等基因系中表达规律研究

王晓丹，肖 钢，张振乾，官春云，陈社员，邬贤梦，张诗远

(湖南农业大学农学院/南方粮油作物协同创新中心，湖南 长沙 410128)



光合作用合成相关差异蛋白对应基因在高油酸油菜近等基因系中表达规律研究

王晓丹，肖 钢，张振乾*，官春云，陈社员，邬贤梦，张诗远

(湖南农业大学农学院/南方粮油作物协同创新中心，湖南 长沙 410128)

【目的】本文探索了光合作用相关基因表达与蛋白表达之间的关系，加速高油酸油菜育种进程。【方法】以高油酸油菜近等基因系出苗后7 d、5～6叶期和越冬期的叶片、花瓣和授粉后20～35 d的种子及角果皮为材料，利用定量PCR方法研究9个iTRAQ分析得到的差异蛋白对应基因在不同生育期表达规律。【结果】在出苗后7 d、花期和授粉后20～35 d，高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜；5～6叶期、越冬期高油酸油菜的光合作用能力高于低油酸油菜。gi|515616基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料及低油酸油菜5～6叶期、越冬期叶片和授粉后20～35 d角果皮中不表达，在花、授粉后20～35 d种子中均不表达。gi|297853098, gi|297825149和gi|312282567基因及gi|50313237和gi|79475768基因分别具有相同的表达规律。gi|297825149基因在高油酸油菜角果皮中是唯一上调表达基因。gi|312282897基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料为唯一上调表达基因。【结论】这些基因可作为高油酸油菜育种材料筛选的参考基因，加快育种进程。

实时荧光定量PCR；光合作用；高油酸油菜

【研究意义】蛋白质组学是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，被认为是在基因组学和转录组学之后，生物系统研究的下一步[1-2]。然而，蛋白质组的研究远比基因组学复杂，蛋白质有很高的细胞特异性，即使是同一细胞的不同时期或在不同的环境下，它表达的蛋白质也不尽相同[3]；同时，机体所处的不同环境和本身的生理状态差异，会导致基因转录产物有不同的剪切和转译成不同的蛋白，一个基因可能会产生几个，甚至几十个蛋白质[4]。iTRAQ技术是2004年新开发的同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术[5]，可以对样本中的几乎所有蛋白质进行标记，从而获得更为详尽的样品信息[6]，重复性和稳定性高[7]。该技术在油菜分子生物学研究中也有不少应用[8-9]，本实验室利用iTRAQ定量蛋白质组技术对高油酸油菜授粉后20～35 d种子进行分析[10]，得到与光合作用相关的差异蛋白。【前人研究进展】不同生育期及不同器官的基因表达情况对于作物性状育种研究有十分重要的意义，Abdelghani N等[11]采用定量PCR方法研究了与脂肪酸合成相关的基因在高油酸低亚麻酸埃塞俄比亚芥中的表达规律，发现基因在种子外的器官中的表达情况在育种研究中也很有应用价值。Noelle A等[12]通过利用实时荧光定量PCR方法检测高油酸花生及其野生型种子和叶片中FAD2基因表达量快速检测高油酸花生基因型。同时，本实验室对转录组分析得到的光合作用相关差异基因在不同生育期及不同器官中的表达情况研究发现，一些基因的表达有规律，可用于高油酸油菜育种材料早期筛选研究[13]。光合作用是生物界赖以存在的基础，也是农作物产量形成的基础[14]，作物中90 %以上的干物质直接来源于光合作用[15]，光合作用能力强有助于积累更多的干物质，获得更高的产量[16]。吕亚等[17]以木薯栽培种ZM-QZ1 为材料，采用双向电泳方法，研究一天中不同时间点叶片光合作用差异蛋白的变化。结果发现与光合作用相关的关键蛋白表达水平与净光合速率在5 个时间点的变化趋势一致，表明这些蛋白质的表达水平与光合作用强度密切相关。Silke H等[18]利用实时荧光定量PCR方法研究了光合作用相关基因在玉米叶片中表达情况。因此，研究光合作用相关的差异蛋白对应基因的表达规律对于了解基因与光合作用之间的关系、作物产量等方面研究有十分重要的意义。【本研究切入点】在本研究中，采用实时荧光定量PCR方法对与光合作用相关的差异蛋白对应基因在不同生育期的表达规律进行研究。【拟解决的关键问题】以期从中发现基因表达与蛋白表达之间的关系及不同油酸含量油菜的光合作用能力差异，为高油酸油菜育种提高参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

高油酸油菜近等基因系材料由湖南农业大学油料所提供。本试验研究的基因为高油酸油菜近等基因系材料授粉后20～35 d种子iTRAQ分析得到光合作用相关差异蛋白(差异在1.5倍以上)对应基因。低油酸油菜(油酸含量56.2 %)为对照组，高油酸油菜(油酸含量81.4 %)为处理组。

仪器设备：Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(Thermo Scientific)，CFX96 CFX384荧光定量PCR(Bio-Rad)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 在出苗后7 d去根幼苗，5～6叶期(2015年12月10日)和越冬期(2016年1月5日)顶部叶片，盛花期(2016年3月18日)的花(自交套袋)，在授粉后20～35 d(2015年4月17日)未成熟种子及角果皮，以上材料各取10株，混合保存于-80 ℃备用。

1.2.2 RNA提取 采用TransZol Up Plus RNA Kit(Trans Gene Biotech)提取总RNA，操作方法参照说明书。经Nanodrop 2000检测浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA合格，保存于-80 ℃备用。

1.2.3 定量PCR研究 逆转录、引物合成及定量PCR研究参照文献[13]。试验进行3次，取平均值。需要进行研究的基因及其引物情况如表1所示。

2 结果与分析

2.1 出苗后7 d去根材料中基因表达情况

由图1可知，gi|515616基因在高油酸油菜中不表达，gi|312282897基因在高油酸油菜中上调表达(3.544倍)，其余基因在高油酸油菜中下调表达，其中gi|297853098基因(15.743倍)、gi|6006279基因(13.0倍)差别较大，其次是gi|42571703基因(5.367倍)和gi|297825149基因(3.326倍)。在出苗后7 d，7个基因在高油酸油菜材料中下调表达，表明此时期高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜。

2.2 5～6叶期叶片中基因表达情况

从图2可看出，gi|515616在低油酸油菜叶片中不表达，gi|297853098(2.837倍)，gi|312282897(3.950倍)在高油酸油菜叶片中下调表达，其余基因在高油酸油菜叶片中上调表达，其中gi|42571703(35.438倍)差别较大，其次是gi|297825149(4.754倍)和gi|79475768(3.377倍)。6个基因在高油酸油菜叶片中上调表达，表明在此时期高油酸油菜的光合作用能力强于低油酸油菜。

表1 与光合作用相关蛋白对应基因及其引物

图1 与光合作用相关差异蛋白对应基因在出苗后7 d材料中的表达情况Fig.1 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 7-day seedlings

图2 与光合作用相关差异蛋白对应基因在5～6叶期不同材料叶片中表达Fig.2 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 5-6 leaf stage leaves

2.3 越冬期叶片中基因表达情况

由图3所示，gi|515616在低油酸油菜叶片中不表达，gi|79475768(3.607倍)、gi|312282567(3.198倍)和gi|50313237(1.245倍)在高油酸油菜叶片中下调表达，其余的基因在高油酸油菜中上调表达，其中gi|42571703(36.350倍)、gi|312282897(27.511倍)、gi|6006279(10.375倍)和gi|297853098(3.198倍)差别较大。5个基因在高油酸油菜叶片中上调表达，表明在此时期高油酸油菜的光合作用能力强于低油酸油菜。

2.4 花中基因表达情况

如图4所示，gi|42571703(84.0倍)，gi|312282897(8.081倍)在高油酸油菜花中上调表达，gi|515616在2种油菜花中均不表达，其余的基因在高油酸油菜花中下调表达，其中gi|297853098(25.714倍)和gi|312282567(14.944倍)差别较大， 其次是gi|79475768(5.239倍)、gi|50313237(3.949倍)和gi|297825149(2.309倍)。6个基因在高油酸油菜花中下调表达，表明在花中高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜，也可能与采用的材料有关，光合作用主要发生在叶片中。

图3 与光合作用相关差异蛋白对应基因在不同材料越冬期叶片中表达Fig.3 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in overwintering period leaves

图4 与光合作用相关差异蛋白对应基因在不同材料花中的表达Fig.4 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in flowers

2.5 授粉后20～35 d种子中基因表达情况

如图5所示，gi|515616在高油酸油菜授粉后20～35 d种子中不表达，gi|42571703(261.333倍)、gi|312282897(78.40倍)、gi|6006279(30.745倍)和gi|297825149(6.426倍)在高油酸油菜授粉后20～35 d种子中下调表达，gi|312282567(6.144倍)、gi|79475768(2.953倍)、gi|297853098(2.716倍)和gi|50313237(1.807倍)在高油酸油菜授粉后20～35 d种子中上调表达。

2.6 授粉后20～35 d角果皮中基因表达

从图6可看出，gi|515616在低油酸油菜角果皮中不表达，gi|297825149(1.150倍)在高油酸油菜角果皮中上调表达，其余基因在高油酸油菜角果皮中下调表达，其中仅gi|6006279(3.13倍)和gi|312282567(2.4倍)差别在2倍以上。7个基因在高油酸油菜角果皮中下调表达，表明在此时期高油酸油菜的光合能力低于低油酸油菜，成熟期产量形成的重要时期，光合作用能力低可能是导致高油酸油菜与普通油菜产量存在一定差异的原因。

图5 与光合作用相关差异蛋白对应基因在授粉后20～35 d种子中的表达Fig.5 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 20-35 day seeds after pollination

图6 与光合作用相关差异蛋白对应基因在授粉后20～35 d角果皮中的表达Fig.6 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 20-35 day pod skin after pollination

3 讨 论

由于基因表达的条件和表达的程度则随时间、地点和环境条件而不同, 因而一个基因可以表达的蛋白质数目可能远大于一[4]。在本研究中，gi|312282897和gi|312282567为芜菁甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，表达的蛋白质有2个；而甘蓝型油菜正捕光色素蛋白复合物II类型III叶绿素a-b结合蛋白在授粉后20～35 d的种子中存在，而gi|515616基因在授粉后20～35 d的种子中不表达，可能是由于其它基因的表达产物随时间、地点和环境条件发生改变或经过翻译后修饰和剪接，产生改变形成该蛋白质，与甘蓝型油菜正捕光色素蛋白复合物II类型III叶绿素a-b结合蛋白对应基因并非是导致该蛋白质表达的基因，因而在该时期种子中没有表达。

在本研究中，发现gi|515616基因在不同生育期的表达情况不同，可以此作为某个时期油菜高油酸材料筛选的指示基因，根据其是否表达来初步判断该材料是否为需要的高油酸材料。同时，gi|297825149基因(高油酸油菜角果皮中是唯一上调表达基因)和gi|312282897基因(高油酸油菜出苗后7 d去根材料中为唯一上调表达基因)也可作为某个时期选择育种材料的基因；另外，gi|312282567基因、gi|50313237基因和gi|79475768基因及gi|297853098基因和gi|297825149基因有相同的表达规律，这些基因的表达规律均可用于高油酸油菜育种材料早期筛选研究，减少大量繁琐的田间工作，加快育种进程。

Guan等[19]采用基因芯片技术对甘蓝型油菜高油酸(71.71 %)和低油酸(55.6 %)材料进行分析发现，丙酮酸激酶为重要差异表达基因，且在高油酸材料中上调表达。这与本研究发现的该蛋白对应基因gi|79475768在授粉后20～35 d表达情况一致。丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP和丙酮酸, 控制着丙酮酸的外流量。因此，丙酮酸激酶的基因上调, 将影响整个脂肪酸代谢过程[19]。

4 结 论

利用高油酸油菜近等基因系材料，对iTRAQ分析得到的9个与光合作用相关差异蛋白对应基因在不同生育期表达规律进行研究。

(1)gi|515616基因在不同生育期表达情况不同，在高油酸油菜出苗后7 d去根材料中不表达，低油酸油菜5～6叶期、越冬期叶片和授粉后20～35 d角果皮中不表达，在花中、授粉后20～35 d种子中均不表达。gi|312282897基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、越冬期叶片和花中上调表达，其中在高油酸油菜出苗后7 d去根材料为唯一上调表达基因，在高油酸油菜5～6叶期叶片、授粉后20～35 d种子和角果皮中下调表达。gi|297853098基因和gi|297825149基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、5～6叶期叶片、花和授粉后20～35 d角果皮中下调表达，越冬期叶片和授粉后20～35 d种子中上调表达，其中gi|297825149基因在高油酸油菜角果皮中是唯一上调表达基因。gi|6006279基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、花、授粉后20～35 d种子和角果皮中下调表达，5～6叶期和越冬期叶片中上调表达。gi|42571703基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、授粉后20～35 d种子和角果皮中下调表达，5～6叶期和越冬期叶片及花中上调表达。gi|312282567基因、gi|50313237基因和gi|79475768基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、越冬期叶片、花和授粉后20～35 d角果皮中下调表达，5～6叶期叶片和授粉后20～35 d种子中上调表达。

(2)在出苗后7 d材料中，有7个基因在高油酸油菜中下调表达；在花中，有6个基因在高油酸油菜花中下调表达；授粉后20～35 d角果皮中，有7个基因在高油酸油菜材料中下调表达；表明在出苗后7 d、花期和授粉后20～35 d高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜。5～6叶期叶片中，6个基因在高油酸油菜中上调表达；越冬期叶片中5个基因在高油酸油菜中上调表达；表明在5～6叶期、越冬期高油酸油菜的光合作用能力高于低油酸油菜。

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(责任编辑 陈 虹)

Expression Patterns of Genes according to Photosynthesis-relatedDifferential Proteins in High Oleic Acid Rapeseed Isogenic Lines

WANG Xiao-dan, XIAO Gang, ZHANG Zhen-qian*, GUAN Chun-yun, CHEN She-yuan, WU Xian-meng, ZHANG Shi-yuan

(College of Agriculture, Hunan Agricultural University/Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Hunan Changsha 410128, China)

【Objective】In this paper, the relationship between gene expression and protein expression in photosynthesis were discovered so that the process of high oleic acid rape breeding could be accelerated. 【Method】The 7 days after emergence, 5-6 leaf stage, leaves of wintering period, petals, seeds and pods skins 20-35 days after pollination of high oleic acid rapeseed isogenic lines were used as tested materials to find out the expression rules in different development periods. The nine corresponding genes of the differential proteins which derived from the iTRAQ analysis were studied by Real-time quantitative PCR.【Result】In the development of 7 days after emergence, flowering and pollination 20-35 days, high oleic acid rapeseed had lower photosynthesis ability than low oleic acid rapeseed, while in the stages of 5-6 leaf and over-wintering, high oleic acid rapeseed had higher photosynthesis ability than low oleic acid rapeseed. Gi|515616 gene did not exist in high oleic acid rape of 7 days after emergence, the leaves of 5-6 leaf stage and over-wintering stage, pod skins 20-35 days after pollination of low oleic acid rapeseed, flower and seed 20-35 days after pollination of the two lines. The genes of gi|297853098, gi|297825149 and gi|312282567 had the same expression rules, while gi|50313237 and gi|79475768 had the same expression rules too. Gi|297825149 and gi|312282897 were the only up-regulated gene in pods skins and 7 days after emergence of high oleic acid rapeseed respectively.【Conclusion】These genes could be used as reference genes to screen high oleic acid rapeseed breeding materials, which would be useful to speed up the breeding process.

Real-time quantitative PCR；Photosynthesis；High oleic acid rapeseed

1001-4829(2017)7-1483-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.003

2016-07-23

国家自然科学基金“基于蛋白组学的油菜高油酸关键基因鉴定研究”(31201240)；国家973计划“主要环境因子及生育期影响油菜油脂积累的分子基础”(2015CB150206)；国家科技支撑计划“油菜商业化育种研究与模式示范”(2014BAD01B07)；湖南省科技重大专项“高油酸油菜产业化发展关键技术研究与示范”(2014FJ1006)；作物种质创新与资源利用国家重点实验室培育基地开放课题“与脂肪酸合成相关基因表达量研究及其功能验证”；湖南农业大学作物学开放基金“高油酸油菜近等基因系差异基因研究”(ZWKF201302)

王晓丹(1992-)，女，河南郑州人，在读研究生，从事油菜育种研究，Tel：13838378556，E-mail：13838378556@139.com；*为通讯作者：张振乾(1977-)，男，河南南阳人，副教授，博士，从事油菜育种研究，Tel：15974175419，E-mail：zzq770204@163.com。

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