紫苏醛-海藻酸钠复合涂膜抗花生黄曲霉菌研究

张初署,于丽娜,毕 洁,孙 杰,*,胡玉忠,赵善仓(.山东省花生研究所,山东青岛 6600; .青岛东生集团股份有限公司,山东青岛 66600 .山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,山东济南 50000)



紫苏醛-海藻酸钠复合涂膜抗花生黄曲霉菌研究

张初署1,于丽娜1,毕 洁1,孙 杰1,*,胡玉忠2,赵善仓3
(1.山东省花生研究所,山东青岛 266100; 2.青岛东生集团股份有限公司,山东青岛 266600 3.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,山东济南 250000)

花生极易在储运过程中因黄曲霉菌的快速生长繁殖受到黄曲霉毒素的污染,为了更好地防控花生受到黄曲霉毒素的污染,本文以海藻酸钠和紫苏醛为原料,甘油为增塑剂,以抑制黄曲霉菌生长活性为主要评价指标,研究紫苏醛-海藻酸钠复合涂膜最佳配方及复合涂膜花生的储藏条件。结果表明,海藻酸钠浓度6 mg/mL,活性物紫苏醛0.015 mg/mL,甘油浓度6 mg/mL时制备的复合膜抗黄曲霉生长活性能力最佳,抑菌直径达到(7.23±0.11)cm。紫苏醛添加方式对涂膜花生黄曲霉菌抑制效果影响很大,最佳添加方式为熏蒸,涂膜花生贮藏温度应在25 ℃以下,贮藏环境相对湿度为60%以下。

紫苏醛,海藻酸钠,复合涂膜,黄曲霉菌,花生

黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是一类主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等真菌产生的次级代谢产物,具有强的致癌性和致突变性。花生是最容易感染黄曲霉的农作物之一,黄曲霉毒素对花生具有极高的亲和性[1-4]。在花生的贮藏运输过程中,由于花生含有丰富的营养物质极易引起侵染的黄曲霉菌生长、繁殖和产毒,造成花生中黄曲霉毒素的污染。贮运过程中黄曲霉毒素污染严重影响着花生制品的食用安全,已成为制约花生产业发展和食用安全的最大影响因子,控制花生中黄曲霉毒素的污染势在必行[5-8]。目前花生在贮运过程中黄曲酶毒素污染防控已成为研究热点。

涂膜法是将涂膜剂涂于物体表面,形成一层弹性薄膜,有效地抑制微生物的生长繁殖,延长其储藏期[9-11]。目前国内外研究较多的可食性涂膜剂主要有多糖类膜、蛋白质膜和脂质膜等[12-13],其中多糖类的海藻酸钠保鲜剂,具有优良的分散性、保湿性、成膜性、无毒无味、可生物降解、生物相容性好等诸多优点,已广泛应用于大枣、芒果、苹果等水果贮藏中[14-16],但未见应用于花生贮藏中的报道。

紫苏醛是天然植物紫苏叶中的一种重要活性成分,具有抗炎、抗氧化等生理活性,应用广泛[17]。但紫苏醛在抑菌方面研究较少,在抑制黄曲霉菌方面的研究上未见报道。因此本文以食品多糖海藻酸钠和天然植物活性成分紫苏醛为涂膜材料,研究复合涂膜对黄曲霉菌的抑制作用并研究了复合涂膜花生适宜的储藏条件,为花生黄曲霉菌的防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花生仁 市售;海藻酸钠 青岛四季科技发展有限公司;冰醋酸、紫苏醛 国药集团化学有限公司;黄曲霉菌株 来自于本实验室保藏菌株;查氏培养基、MEA培养基和DG18培养基 均购于青岛海博生物技术有限公司。

HR40-IIA2生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司;HPX-160BSH-III恒温恒湿培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;YXQ-L31-400立式压力蒸汽灭菌器 四川省新德医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄曲霉菌的活化及菌悬液的制备 将黄曲霉菌接种于MEA培养基上,30 ℃培养3 d[18]。向活化的黄曲霉菌株中加4 mL无菌蒸馏水,摇晃均匀,稀释至孢子浓度为102个/mL。

1.2.2 紫苏醛-海藻酸钠复合膜的制备 称取一定量的海藻酸钠粉末于锥形瓶中,溶于一定体积的蒸馏水中,搅拌均匀,加热至完全溶解,加入适量甘油。待冷却至室温后,加入一定量的紫苏醛,配制不同浓度的涂膜液备用。

1.2.3 紫苏醛-海藻酸钠复合膜各因素对黄曲霉抑制效果及正交实验

1.2.3.1 紫苏醛浓度对黄曲霉抑制效果 以海藻酸钠浓度为12 mg/mL,甘油浓度为6 mg/mL,紫苏醛的浓度分别为0、0.002、0.005、0.015、0.025,制备不同紫苏醛浓度的复合膜液,测定抑菌直径。

1.2.3.2 正交实验设计 在单因素分析的基础上,以紫苏醛、海藻酸钠[13-15]和甘油[9]的浓度为实验因素,确定三因素三水平的L9(33)正交实验,确定最佳黄曲霉抑制效果。

表1 紫苏醛-海藻酸钠复合膜正交实验因素与水平Table 1 The orthogonal experiment factors and levels of perillaldehyde sodium alginate composite membrane

1.2.4 紫苏醛-海藻酸钠复合膜花生抗黄曲霉菌贮藏条件研究

1.2.4.1 紫苏醛添加方式对抗黄曲霉菌效果的影响 紫苏醛的添加方式有两种。方式一是以优化得到的紫苏醛-海藻酸钠复合涂膜配方制备涂膜液,将花生浸泡于涂膜液中,倒入裹衣机中,开机搅拌使涂膜液均匀的分布于花生的表面,待花生表面的涂膜液干燥后放入灭菌的锥形瓶中,加入 100 μL 102个/mL黄曲霉孢子悬液,在相对湿度为60%环境下,30 ℃培养10 d后测定花生中黄曲霉菌的个数;

方式二是将第一种方法中使用的相同量的紫苏醛混匀花生中,密封于密封袋30 ℃熏24 h,使紫苏醛充分浸入花生中,再将花生浸泡于海藻酸钠和甘油的混合液(浓度与第一种方法相同)中,倒入裹衣机中,开机搅拌使涂膜液均匀的分布于花生的表面,待花生表面的涂膜液干燥后放入灭菌的锥形瓶中,加入100 μL 102个/mL黄曲霉孢子悬液,与方式一中相同的条件培养,测定花生中黄曲霉菌的个数;对照为没有进行涂膜的花生。

1.2.4.2 贮藏温度对紫苏醛-海藻酸钠复合抗黄曲霉菌效果的影响 将10 g涂膜的花生放入灭菌的锥形瓶中,加入100 μL 102个/mL黄曲霉孢子悬液,在相对湿度为60%环境下,分别在10、20、25、30、35 ℃培养10 d,测定花生中黄曲霉菌的个数。

1.2.4.3 贮藏环境相对湿度对紫苏醛-海藻酸钠复合抗黄曲霉菌效果的影响 将涂膜的花生放入灭菌的锥形瓶中,加入100 μL 102个/mL黄曲霉孢子悬液,在相对湿度为40%、60%、80%的恒温恒湿培养箱中,在1.2.4.2确定的适宜温度内培养10 d,测定花生中黄曲霉菌的个数。

1.2.5 测定方法

1.2.5.1 抑菌实验 制备直径9 mm灭菌滤纸片,浸没于紫苏醛-海藻酸钠复合膜液中,浸泡5 min,取出控干多余的复合膜液,置于察氏培养基的表面,最后用移液枪吸取20 μL 102个/mL黄曲霉孢子悬液滴于滤纸片表面,放置1 h后,放入温度为30 ℃的恒温培养箱中培养7 d,测定黄曲霉菌的菌落生长直径M1。对照为将直径9 mm灭菌滤纸片浸没于蒸馏水中,其它同上,测定对照黄曲霉菌的菌落直径为M2。抑菌直径=M2-M1[9]。

1.2.5.2 花生中黄曲霉菌个数的测定 向花生中加入10倍体积的灭菌的生理盐水,轻轻振荡5 min,制成菌悬液;稀释适宜的浓度后取0.1 mL涂布与DG18培养基上,30 ℃培养7 d,计算培养基上黄曲霉菌落数(以培养基上菌落数10个为宜),并计算花生中黄曲霉菌数。

1.3 数据处理

表2 不同浓度的紫苏醛对黄曲霉菌的抑制Table 2 Inhibition of different concentrations of Perilla aldehyde on Aspergillus flavus

2 结果与分析

2.1 紫苏醛-海藻酸钠复合膜中紫苏醛浓度抑制黄曲霉菌的研究

研究不同浓度的紫苏醛浓度对黄曲霉菌的抑制效果,结果见表2。由表2可以看出,不添加紫苏醛的涂膜液对黄曲霉菌没有抑制作用;紫苏醛浓度在0.015 mg/mL以下时,随着紫苏醛浓度的增加抑菌直径增加显著;当紫苏醛浓度超过0.015 mg/mL,随着紫苏醛浓度的增加,抑菌直径变化不大。因此确定紫苏醛浓度抑制黄曲霉菌适宜范围为0.005～0.015 mg/mL。目前对于植物精油的抑菌性是研究的热点,所涉及的精油主要有香芹酚[19]、百里香酚20]、丁香粉[21]、肉桂醛[22]、柠檬醛[23]等,在食品贮藏中的主要应用于在果蔬[24,25]、肉类产品[26]、鱼类产品[27]、乳制品[28]以及粮食[29]等食品的储藏保鲜中。但紫苏醛在抑菌方面的研究较少。复合涂膜剂中添加紫苏醛的能够很好的抑制花生黄曲霉菌的生长繁殖。

2.2 紫苏醛-海藻酸钠复合膜配方的优化

以海藻酸钠浓度、紫苏醛浓度和甘油浓度为因素,以抑制黄曲霉菌生长活性(抑菌直径)为主要评价指标,获得复合涂膜各因素对黄曲霉抑制效果的主次顺序为B紫苏醛浓度>C甘油浓度>A海藻酸钠浓度,其中紫苏醛浓度对抑菌效果的影响最大,从表2可以看出,紫苏醛浓度的变化对抑菌直径的结果影响明显;由K值得最佳抑菌效果为A1B3C2,海藻酸钠浓度6 mg/mL,活性物紫苏醛0.015 mg/mL,甘油浓度6 mg/mL,制备复合膜抗黄曲霉生长活性最佳,验证实验(3个平行)发现,该黄曲霉菌培养7 d后抑菌直径为(7.23±0.11) cm。

表3 紫苏醛-海藻酸钠复合膜正交实验结果Table 3 The orthogonal test experiment results of perilla aldehyde varnish

2.3 紫苏醛-海藻酸钠复合涂膜花生抗黄曲霉菌贮藏工艺研究

2.3.1 紫苏醛添加方式对抗黄曲霉菌效果的影响 由表4的结果可以看出,紫苏醛的添加方式对黄曲霉菌的抑制效果有很大影响,将紫苏醛与花生在密封袋中30 ℃熏24 h后再进行涂膜(方式二),30 ℃培养10 d后花生中黄曲霉菌的个数为0.25×102个,而不经过紫苏醛熏蒸,直接涂膜的花生(方式一),30 ℃培养10 d后花生中黄曲霉菌的个数为0.258×104个,紫苏醛熏蒸抑菌效果明显好于不经过熏蒸的。但两种添加方式与对照(0.756×109)比均能够有效抑制黄曲霉菌。表明紫苏醛添加方式对涂膜花生黄曲霉菌抑制效果有很大影响,紫苏醛作为一种香气成分,易挥发,如果仅将紫苏醛涂于花生表面,在裹衣机热风的作用下,紫苏醛大部分挥发到空气中,很难进入花生中起到抑菌的作用;同时涂抹于花生表面的紫苏醛在花生贮运过程中会很快挥发到空气中,很难起到对花生黄曲霉菌的抑制作用,因此先将紫苏醛和花生密封熏蒸后,使紫苏醛浸入花生内部,再进行涂膜,将紫苏醛封于花生内,可以提高紫苏醛的抑菌效果,延长紫苏醛的抑菌时间。

表4 紫苏醛的添加方式对复合涂膜花生黄曲霉菌的抑制效果Table 4 Inhibitory effect of perillaldehyde adding way on Aspergillus flavus in Peanut with composite coating

表5 贮藏温度对复合涂膜花生黄曲霉菌的抑制效果Table 5 Inhibitory effect of storage temperature on Aspergillus flavus in Peanut with composite coating

2.3.2 贮藏温度对紫苏醛-海藻酸钠复合抗黄曲霉菌效果的影响 将经过紫苏醛熏蒸的涂膜花生在不同温度下贮藏,由表5可以看出,在10～25 ℃环境下贮藏10 d,接种0.1×102黄曲霉孢子的花生黄曲霉总数变化不大,30 ℃以后黄曲霉菌增长迅速,因此对于紫苏醛海藻酸钠复合涂膜的花生,最佳的储藏温度为25 ℃以下。贮藏温度越低,防霉效果越好,但从经济学的角度考虑,贮藏温度降低,会大大提高贮藏的成本,因此本研究的复合涂膜贮藏能将花生的贮藏温度提高到室温25 ℃,可以明显降低贮藏成本。

2.3.3 贮藏环境相对湿度对紫苏醛-海藻酸钠复合抗黄曲霉菌效果的影响 将复合涂膜花生贮藏于不同的环境湿度中,由表6可以看出,环境湿度在40%和60%下,在25 ℃贮藏10 d后花生中黄曲霉菌数分别为0.112×102和0.125×102个菌落数,与原始接种量0.1×102黄曲霉孢子变化不大,而当环境相对湿度达到80%时,花生黄曲霉菌的个数迅速升到1.02×104,因此对于复合涂膜花生适宜的贮藏相对湿度应在60%以下。

表6 贮藏环境相对湿度对复合涂膜花生黄曲霉菌的抑制效果Table 6 Inhibitory effect of storage environment relative humidity on Aspergillus flavus in Peanut with composite coating

3 结论

以海藻酸钠浓度、紫苏醛浓度和甘油浓度为因素,以抑制黄曲霉菌生长活性(抑菌直径)为主要评价指标,通过优化获得复合涂膜各因素对黄曲霉抑制效果的主次顺序为紫苏醛浓度>甘油浓度>海藻酸钠浓度,复合涂膜的最佳配方为海藻酸钠浓度6 mg/mL,活性物紫苏醛0.015 mg/mL,甘油浓度6 mg/mL,此配方制备的复合膜抗黄曲霉生长活性最佳,抑菌直径达到(7.23±0.11) cm,能很好的抑制黄曲霉菌的生长繁殖。紫苏醛添加方式对涂膜花生黄曲霉菌抑制效果有很大影响,紫苏醛的最佳添加方式为熏蒸,复合涂膜花生适宜的贮藏温度在25 ℃以下,贮藏环境相对湿度为60%以下。

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The anti-Aspergillusflavusactivity of composite coating of perillaldehyde-sodium alginate in peanut

ZHANG Chu-shu1,YU Li-na1,BI Jie1,SUN Jie1,*,HU Yu-zhong2,ZHAO Shan-cang3

(1.Shandong Peanut Research Institute,Qingdao 266100,China; 2.QingDao Topsen Group Co.,Ltd.,Qingdao 266600,China； 3.Quality Standards and Testing Institute of Agricultural Technology, Shandong Province Academy of Agricultural Sciences,Ji’nan 250000,China)

Peanut was easily polluted by aflatoxin which was due to the rapid growth and reproduction ofAspergillusflavusduring storage and transportation. In order to better prevention and control peanut aflatoxin contamination,compound coating formulation of perillaldehyde-alginate sodium and storage process of composite coating peanuts was studied with sodium alginate and perillaldehyde paper as raw material,glycerol as a plasticizer,to inhibit the growth ofAspergillusflavusactivity as the main evaluation. The optimum formula was that the concentration of sodium alginate was 6 mg/mL,perillaldehyde was 0.015 mg/mL,glycerol concentration was 6 mg/mL,in which inhibitory diameter achieved(7.32±0.11)cm. The way to add perillaldehyde had great influence to inhibitAspergillusflavusin film peanut,and the best way to add perillaldehyde was fumigation,storage temperature and relative humidity of storage respectively was below 25 ℃ and below 60%.

perillaldehyde;sodium alginate;composite coating;Aspergillusflavus;peanut

2016-08-16

张初署(1981-),女，博士，助理研究员，主要从事花生食品安全方面的研究，E-mail:zcs.2003@163.com。

*通讯作者:孙杰(1981-),女，博士，副研究员，主要从事食品安全与营养方面的研究，E-mail:sjj605@163.com。

山东省农业科学院农业科技创新工程(CXGC2016B17)；山东省农业科学院青年科研基金(2014QNM22)；山东省重点研发计划(2015GGX108006)；山东省农业科学院青年科研基金(2016CGPY10)；山东省自主创新与成果转化(2014CGZH0709)；山东省农业科学院青年英才培养计划；山东省农科院重大科技成果培育计划(2016CGPY10)。

TS201.6

A

1002-0306(2017)14-0263-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.051