基于光强传输方程相位成像的宽场相干反斯托克斯拉曼散射显微背景抑制∗

郑娟娟姚保利邵晓鹏

1)(西安电子科技大学物理与光电工程学院,西安 710071)

2)(中国科学院西安光学精密机械研究所,瞬态光学与光子技术国家重点实验室,西安710119)

基于光强传输方程相位成像的宽场相干反斯托克斯拉曼散射显微背景抑制∗

郑娟娟1)姚保利2)†邵晓鹏1)

1)(西安电子科技大学物理与光电工程学院,西安 710071)

2)(中国科学院西安光学精密机械研究所,瞬态光学与光子技术国家重点实验室,西安710119)

(2016年12月17日收到;2017年3月31日收到修改稿)

相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微能够对样品的特殊化学组分进行选择性成像,无需荧光标记,在生物医学领域被广泛应用.然而,传统的CARS图像往往存在非共振背景信号.本文将基于光强传输方程的单光束相位成像技术用于CARS显微成像,来抑制CARS的非共振背景信号.该方法通过记录样品在三个相邻平面上的CARS图像,然后利用光强传输方程获取CARS光场的相位分布,最后利用共振CARS信号和非共振背景信号在相位上的差异,实现了对背景噪声的抑制.该方法无需参考光,通过三次测量可完成CARS的背景噪声抑制,具有良好的应用前景.

相干反斯托克斯拉曼散射显微,相干成像,相位成像,背景噪声

1 引言

相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)显微成像是一种无需荧光标记、通过探测特定分子的振动来进行三维成像的显微技术.该方法也是目前极具潜力的活体成像的重要手段之一,可以对生物体内脂类(不易被标记)、药物等特定小分子物质,以及核酸、蛋白质等生物大分子进行无标记成像.CARS的成像过程是抽运光和斯托克斯光相互作用的非线性四波混频过程.假定抽运光和斯托克斯光的频率分别为ωP和ωS,当频率差ωP−ωS与样品中的分子振动频率一致,将激发出频率为ωAS=2ωP−ωS的反斯托克斯(anti-Stokes)光.CARS过程涉及四个光子相互作用,该过程满足动量守恒和能量守恒关系,其中CARS信号的强度与激发光强度有以下关系:,式中,ICARS表示CARS信号的强度,IP和IS分别代表抽运光与斯托克斯光的强度.一般情况下,三阶电极化张量χ(3)包括共振部分和非共振部分.其中,共振部分来自于特定的化学键的振动,是人们所关注的信息;非共振部分来自于极化过程中分子内电子的贡献,它的存在使得CARS成像出现背景噪声,降低了CARS图像的信噪比.

迄今为止,人们对CARS成像的背景抑制已经开展了大量研究,例如,已经提出了反向探测法[3]、偏振法[4]、时间分辨法[5]和空间相位控制法[6]等来抑制背景噪声.利用相位成像来抑制CARS的背景噪声已逐渐成为该研究的主流方法:共振和非共振信号在相位上相差π/2,这使得通过相位成像来抑制背景噪声成为可能.光学外差探测方法[7−12]就是通过这一点实现共振和非共振CARS信号的分离:该方法在CARS显微镜的基础上,引入一个独立的参考光,和分子辐射出的CARS光场进行干涉,利用相移技术可以从干涉图样中分离出共振信号和背景信号,达到去除背景噪声的目的.该方法有较高的精度,但是需要引入一个独立的参考光场和CARS光场进行干涉,增加了装置的复杂性.同时,该方法对环境扰动(例如振动、温度变化等)比较敏感.近期研究人员采用波前探测器来获取CARS复振幅的相位,这种方法不需要参考光,可以进行相位成像[13,14].然而,该方法需要价格昂贵的高精度波前探测器,并且其空间分辨率受到了微透镜孔径的限制,不能满足生物成像对分辨率方面的要求.我们也曾提出基于强度迭代的单光束相位成像技术来分离去除CARS成像中的背景噪声[15],该方法需要记录一系列的强度分布,通过迭代算法重构出CARS信号的相位分布.

光强传输方程(transport of intensity equation,TIE),于1983年由Teague[16]利用亥姆霍兹方程在傍轴近似条件下首次推导得出.TIE是一个二阶椭圆型偏微分方程,阐明了平行于光轴方向上光强度的变化量与光波的相位之间的定量关系.与基于强度迭代的单光束相位成像技术[15]相比,该方法无需通过迭代来恢复相位,而是利用样品像面附近的三幅光强分布(直接测量),通过数值求解光强传输方程,直接获取物光波的相位分布.相比于传统基于干涉的相位测量方法,该方法具有无需参考光、对照明光相干性要求低(可利用传统明场显微镜中的卤素灯科勒照明或LED照明)、无需相位解包裹(直接获得绝对相位)、无需复杂的光学系统及苛刻的实验环境等诸多独特优势.在TIE相位成像的应用方面:Roddier[17]将光强传输方程TIE应用于自适应光学领域.Nugent等[18,19]成功地将基于TIE的相位成像技术应用于X射线衍射成像与中子射线成像领域.近年来,基于TIE的相位成像技术还被广泛应用于电子显微学[20]、光学显微定量相位成像[21,22].例如,左超等[23]将光强传输方程理论应用在活细胞的动态高分辨率定量相位显微成像等.

本文将基于光强传输方程的相位成像应用于CARS显微,实现了对CARS非共振背景信号的有效抑制.该方法通过记录样品像面附近三个相邻空间平面上的CARS强度图像,然后采用光强传输方程获取CARS光场的相位分布,实现了对背景噪声的抑制.这种抑制背景噪声的方法无需参考光,装置简单,实用性强,对于高信噪比CARS成像具有一定的借鉴意义.

2 基于TIE的CARS相位成像技术

图1 (网刊彩色)CARS相位成像装置示意图Fig.1.(color online)Schematic setup for CARS phase imaging.

基于TIE的CARS相位成像所采用的实验装置如图1所示:一波长为532 nm的Neodymium-Vanadate激光器用来抽运一个Titanium-Sapphire激光器,输出重复频率为76 MHz,波长为829.93 nm的脉冲激光.输出的激光经光束分束器分成两束:第一束光被用作斯托克斯光,另一束经过一光学参量放大器OPO,产生在600—1000 nm范围内波长可调谐的抽运光.抽运光和斯托克斯光分别经过望远镜系统L3-L4和L1-L2缩束5倍,然后通过二向色分光镜BS的合束作用实现空间上重合在一起.通过调节时间延迟装置,使得抽运光和斯托克斯光在时间上实现脉冲重合.重合的两束光经过物镜MO1聚焦到样品上.产生的CARS信号通过物镜MO2和透镜L5组成的望远镜系统成像到CMOS相机上.滤光片(Semrock FF01-650/SP-25和FF01-563/9-25)用来滤掉抽运光和斯托克斯光.该成像系统总放大倍率为60倍,成像视场大小为50µm×50µm.物镜MO2的数值孔径为0.75,决定了成像装置的横向分辨率为458 nm.

在CARS成像过程中,通过调节抽运光的波长,使得抽运光和斯托克斯光的频率差与样品的共振频率相匹配.当调节斯托克斯光和抽运光之间的频率差与样品中分子的振动键相匹配时,样品在共振模式下辐射出共振CARS信号.当斯托克斯光和抽运光的频率差调到远离样品分子的振动区域时,样品在非共振模式下产生CARS背景信号非共振CARS场和共振CARS场可以分别表示为[13−15]

φχ常被称为振动相位.由(2)式可知,当没有共振信号时,φχ等于零;有共振信号存在时,由共振和非共振CARS场的比值决定φχ的值,φχ的具体范围在0到π/2之间.反而言之,利用该相位差异可以实现CARS光场的去背景:表示去除背景噪声后的CARS光场,表示共振模式下CARS信号的总强度.在本文提出的方法中,我们对共振模式和非共振模式下的CARS光场分别进行相位成像,最后得到φχ,从而对非共振信号进行抑制.

在本文提出的方法中,为了求解CARS光场(如共振模式下的CARS光场)的相位分布,我们记录沿轴向方向样品像平面附近三个空间平面内的强度图样I−1(x,y),I0(x,y)和I1(x,y),如图2所示.根据光TIE,这三个强度分布和光场的相位存在以下关系:

这里,φ0(x,y)为像平面的相位.∇=∇xex+∇yey是在x-y平面的二维梯度算符;ex,ey是单位方向矢量;λ是光波波长;z是相邻平面间的距离.在求解φ0(x,y)过程中,用一个辅助函数∇ψ来取代(3)式中I0∇φ0[24−26]:

图2 (网刊彩色)TIE-CARS相位成像示意图Fig.2.(color online)Schematic diagram for TIECARS phase imaging.

这里,FT{·}是二维傅里叶变换算符;κx和κy分别是在x和y方向的频谱坐标.通过对(5)式取逆傅里叶变换可解出ψ(x,y).再利用I0∇φ0=∇ψ,可以重构相位导数φx和φy.最终,通过利用Frankot–Chellappa算法[27−29]对相位梯度进行积分可以再现出CARS光场的相位分布:

这里,FT{}和IFT{}分别指傅里叶变换算符和逆傅里叶变换算符.该方法仅需要记录三幅强度分布就可以再现出物光场的相位分布,具有相位获取速度快的优点.这个方法直接重构了相位,避免了传统相位成像[30−34]中的相位解包裹程序.然而,上述方法是通过求解相位函数的导数,然后通过(6)式的积分来获取被测场的相位分布.因此,该方法仅可以用于相位连续变化的样品.

图3 (网刊彩色)基于TIE方法的CARS相位成像(a),(b)共振CARS和非共振CARS分别在z=−2,0,2 mm处的强度分布;(c),(d)共振CARS在x和y方向的相位梯度;(e)再现出的共振CARS场的相位分布Fig.3.(color online)TIE based CARS phase imaging:(a)and(b)Intensity distributions at the position z=−2,0,2 mm of the CARS fi eld under resonant and nonresonant mode,respectively;(c)and(d)the phase derivatives of the resonant CARS along x and y direction,respectively;(e)the reconstructed phase of the resonant CARS fi eld by integrating the phase derivations in(c)and(d).

3 实验结果

我们对基于TIE方法的CARS相位成像实验进行了验证.将直径为5µm的聚苯乙烯粒子浸在折射率为1.59的ZnI2溶液中作为样品,其中ZnI2溶液是用来减小聚苯乙烯粒子与周围非共振介质之间的折射率差.我们调节OPO的抽运光的输出波长(光谱宽度0.4 nm)至668.5 nm,和聚苯乙烯的拉曼振动光谱2915 cm−1相匹配,此时对应共振CARS成像模式.通过沿轴向方向在样品的像平面附近移动探测器,记录彼此间隔为2 mm的三幅CARS的强度图像,其强度分布分别如图3(a)所示.同时,调节OPO的输出波长至675 nm,此时为非共振成像模式.同样记录间隔为2 mm的三幅CARS强度图像,如图3(b)所示.

利用(3)—(6)式,可以得到共振和非共振模式下的CARS场的相位分布.图3(c)和图3(d)显示了共振CARS在x和y方向的相位梯度,而图3(e)表示共振模式下CARS场的相位分布.利用相同方法我们也计算了非共振模式CARS光场的相位分布利用(7)式可以得到抑制背景后的CARS强度图像,如图4(b)所示.与传统的CARS图像(如图4(a)所示)相比,图4(a)中聚苯乙烯粒子和周围的ZnI2溶液之间都存在CARS信号,而图4(b)中聚苯乙烯粒子被高亮度地显示出来,非共振背景得到了很好的抑制.

图4 (网刊彩色)基于TIE相位成像技术的CARS背景抑制(a)共振CARS在z=0 mm处的强度分布;(b)聚苯乙烯无背景的CARS强度.Fig.4.(color online)CARS imaging with background suppression based on TIE:(a)Intensity distribution of the resonant CARS image of polystyrene beads at z=0 mm position;(b)intensity distribution of the resonant CARS image after background suppression.

为了更好地验证TIE相位成像技术在CARS去背景上的可行性和有效性,我们将该技术与文献[15]中报道的基于迭代法CARS相位成像技术在CARS去背景上进行了比较.基于迭代的CARS相位方法[15]需要记录不同轴向距离下的多幅CARS强度图像(如图5(a)中I−3,I−2,···,I2,I3所示),通过在这7幅图像之间反复迭代获得CARS光场的相位分布.最后,利用相位图像得到去背景后的CARS强度分布,如图5(b)所示.TIE相位成像技术只需记录CARS光场在像面附近的三幅强度图像(图5(a)中I−1,I0,I1),采用TIE方法获取CARS的相位图像.利用(7)式可以得到去背景后的CARS强度分布,如图5(c)所示.图5(d)定量比较了图5(a)—图5(c)中三条虚线对应的强度分布.方便起见,我们将图像信噪比定义为:CARS共振信号(来自聚乙烯小球中心)与背景噪声(无聚乙烯小球区域强度分布的平均值)之间的比值.传统CARS成像、基于迭代的方法以及基于TIE相位成像方法对应的信噪比分别为:2.8±0.2,102.4±4.6,53.2±3.0.三者的比较说明,基于相位成像的CARS去背景技术都可以有效地抑制CARS成像中的背景噪声.虽然基于迭代的方法[15]具有更好的噪声抑制能力,但是需要记录更多的强度图像.基于TIE相位成像方法仅仅需要记录三幅强度分布,可以将信噪比提高10倍以上,更加适合于快速CARS相位成像.需要说明的是,本文报道的方法以及其他相位成像技术不能提高由系统衍射极限所决定的成像分辨率,仅能减小背景噪声和相位畸变对成像分辨率的影响.

4 结论

CARS显微能够在无需荧光标记的前提下对样品的特殊化学键进行选择性成像.在CARS成像过程中,获取的CARS图像往往存在着非共振背景信号.本文从实验上证明了采用TIE方法可以有效地抑制宽场CARS成像中的非共振背景噪声.该方法是基于光传输的单光束相位成像方法,可以在不需要参考光的前提下实现相位成像,本文利用该方法实现了去除CARS成像中的背景噪声.该方法仅需要记录三幅强度分布就可以再现出物光场的相位分布,相位成像速度快.这个方法直接重构了相位,避免了传统相位成像中的相位解包裹程序.与此同时,本文的方法也存在不足,该方法是通过求解相位函数的导数,然后通过积分来获取被测场的相位分布.因此,该方法仅可以用于相位连续变化的样品.

图5 (网刊彩色)基于TIE相位成像技术与迭代相位成像技术的CARS背景抑制比较(a)在共振模式下CCD沿轴向依次移动2 mm所得的7幅CARS强度图像;(b)利用迭代方法[15]从I−3,I−2,···,I2,I3中所得到的去背景后的CARS图像;(c)利用TIE相位成像方法从I−1,I0和I1中得到的去背景后的CARS图像;(d)图(a),(b),(c)中的虚线对应的强度分布Fig.5.(color online)Comparison of the proposed method with the reported iterative phase imaging method[15]on CARS background suppression:(a)7 intensity distributions recorded of the resonant CARS fi eld at di ff erent axial position with the interval of 2 mm;(b)obtained CARS image with background suppression from I−3,I−2,···,I3by using the iterative method;(c)obtained CARS image from I−1,I0,I1by using TIE based method;(d)intensity pro fi le of the dashed line in(b)and(c).

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PACS:42.65.Dr,42.30.Rx,42.25.Kb,42.30.–dDOI:10.7498/aps.66.114206

Nonresonant background suppression in wide- fi eld coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy with transport of intensity equation based phase imaging∗

Zheng Juan-Juan1)Yao Bao-Li2)†Shao Xiao-Peng1)
1)(School of Physics and Optoelectronic Engineering,Xidian University,Xi’an 710071,China)
2)(State Key Laboratory of Transient Optics and Photonics,Xi’an Institute of Optics and Precision Mechanics,Chinese Academy of Sciences,Xi’an 710119,China)

17 December 2016;revised manuscript

31 March 2017)

Coherent anti-Stokes Raman scattering(CARS)microscopy is a valuable tool for label-free imaging of biological samples,since it enables providing contrast via vibrational resonances of a speci fi c chemical bond.However,in a conventional CARS image the Raman resonant anti-Stokes radiation is often superimposed by a nonresonant contribution arising from the electronic part of the polarization.The situation becomes worse if a sample is composed of a signi fi cant amount of water,where a strong nonresonant background over the whole image is obtained.

To date,various approaches including Epi,polarization sensitive,time-resolved,and CARS phase imaging have been implemented to suppress the undesirable nonresonant background in CARS microscopy.Notably,optical heterodyne based phase imaging schemes are of particular interest due to their intrinsic ability to retrieve Im(χ(3)),which is proportional to the Raman resonant signal.Nevertheless,all the reported phase imaging methods that require an independent reference wave lead to an increase in the setup complexity,thus making the measurement sensitive to external perturbations.In order to simplify the setup,single-beam scheme has also been utilized for vibrational CARS imaging by using wave-front sensors to acquire the phase of the complex anti-Stokes amplitude.However,this method demands highly accurate wave-front sensors.

In this paper we present a reference-less CARS phase imaging technique to suppress nonresonant CARS background based on transport of intensity equation(TIE).Resonant CARS radiationcan be obtained when the frequency di ff erence between the pump and Stokes beams is tuned to match a molecular vibration frequency(Raman resonant mode).In contrast,the nonresonant backgroundcan be obtained when the frequency di ff erence between the pump and Stokes beams does not match a molecular vibration frequency(Raman resonant mode).Considering the fact that there is a phase shift of π/2 between the resonant and non-resonant CARS fi eld,the phase imaging of both resonant and nonresonant CARS fi eld can provide a background-free image.In implementation,three intensity images of the CARS fi eld under resonant mode are recorded at three neighboring planes by moving the CCD camera along the axial direction.In the meantime,three images of the CARS fi eld under non-resonant mode are also recorded.Considering the fact that the TIE links the intensity distributions in three neighboring planes(through which a beam transverses)with the phase distribution of the fi eld,the phase images of the CARS fi eld under both resonant and nonresonant modes are reconstructed from the recorded intensity images.The phase di ff erence φχbetween the resonant CARS fi eld and the non-resonant CARS fi eld is calculated.Eventually,the CARS background is efficiently suppressed by using the relation

Compared with conventional CARS background suppression techniques,the proposed method is robust against environmental disturbance,since it does not require an additional reference beam.Furthermore,the proposed method is easy to incorporate in a conventional CARS con fi guration.Therefore,the proposed method has the potential to become a versatile technique to image deep tissue with low background signal.

coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy,coherent imaging,phase imaging,nonresonant background

10.7498/aps.66.114206

∗国家自然科学基金(批准号:61605150,61475187,61575154,61377008)、中央高校基本科研业务费专项资金(批准号:JB160511,

XJS16005,JBG160502)、the“Thüringer Ministerium für Bildung,Wissenschaft und Kultur”(TMBWK,projects:B578-06001,14.90HWP,B714-07037),and the“Carl Zeiss Stiftung”and the Federal Ministry of Education and Research,Germany(FKZ:13N10508)资助的课题.

†通信作者.E-mail:yaobl@opt.ac.cn

©2017中国物理学会Chinese Physical Society

http://wulixb.iphy.ac.cn

*Project supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.61605150,61475187,61575154,61377008),the Fundamental Research Funds for the Central Universities,China(Grant Nos.JB160511,XJS16005,JBG160502),the‘Thüringer Ministerium für Bildung,Wissenschaft und Kultur’(TMBWK,projects:B578-06001,14.90 HWP,B714-07037),and the‘Carl Zeiss Stiftung’and the Federal Ministry of Education and Research,Germany(FKZ:13N10508).

†Corresponding author.E-mail:yaobl@opt.ac.cn