基于ZnO纳米棒液相自组装固定血红蛋白及其直接电化学传感器

张 琦，段国萍，郭小玉，杨海峰

（资源化学教育部重点实验室，上海师范大学化学系，上海200234）

基于ZnO纳米棒液相自组装固定血红蛋白及其直接电化学传感器

张 琦，段国萍，郭小玉*，杨海峰*

（资源化学教育部重点实验室，上海师范大学化学系，上海200234）

自组装方法制备纳米生物传感器时，常利用聚电解质(如PDDA,poly(diallyl-dimethyl ammonium chloride))与纳米材料和酶的相互作用。但是聚电解质易导致纳米材料团聚，或损害酶的活性，且操作过程较复杂，制备重现性不理想。该工作，利用纳米ZnO与血红蛋白（Hb）等电点差异，直接在纳米材料分散液进行酶混合组装，然后再通过自组装，固定到玻碳电极表面，从而实现了Hb与电极间的直接电子传递。利用紫外吸收光谱（UV-vis）、透射电子显微镜（TEM）及循环伏安等方法对制备过程进行了表征。修饰电极测定H2O2溶液的线性范围是1．06×10-6～7．82×10-3mol/L，检测限是8．86×10-7mol/L（S/N=3）。相同实验条件下，制备电极对相同浓度H2O2的响应电流的相对标准偏差（R．S．D）在1．9%左右，表明该方法制备的生物传感器制备过程简单、有好的稳定性和重现性。

纳米ZnO;血红蛋白;自组装;直接电子传递

0 引言

H2O2是生物体内许多氧化酶反应的副产物，因此制备生物传感器[1-5]对其含量进行测定在生物、临床、食品和环境分析中具有重要意义[6]。检测H2O2有很多种方法，电化学法相对比较好。但是，H2O2的直接电化学检测需要相对较高的超电位[7]。纳米ZnO作为一种半导体材料，有很宽的能带隙，它有较好的生物亲和性，比表面积大，良好的生物相容性和高的电子传递特性[8]且等电点比较高，适合用来固定生物分子，尤其是低等电点的蛋白酶，比如血红蛋白（Hb）。

考虑到利用层层自组装制备基于纳米材料的生物传感器的研究中[9]，遇到的主要技术问题是使用的聚电解质如PDDA（poly(diallyldimethyl ammonium chloride)）易导致纳米材料发生团聚，或可能损害酶的活性，在电极表面的固定过程比较复杂，传感器的重现性不理想。该文开展一种基于生物活性分子与纳米材料等电点不同，先液相组装后再构建修饰电极：即纳米氧化锌分散液和血红蛋白混合组装后，再组装到玻碳电极（GCE）上。研究表明，这种简单易行的制备方法很好的实现了Hb与电极间的直接电子传递,而且对H2O2响应迅速,传感器的制备重现性大大提高。

1 实验部分

1.1 化学试剂

血红蛋白（Hb，来自牛血清，上海生化试剂公司）、纳米ZnO（自制）、H2O2（30%V/V水溶液）、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、H3PO4、KCl、NaOH均为分析纯试剂，HAuCl4、柠檬酸三钠（国药集团化学试剂有限公司），实验所用水为超纯水（＞18MΩ·cm）。

1.2 实验仪器

循环伏安（CV）测量在CHI650电化学工作站（上海辰华公司）上进行，并采用常规的三电极体系。其中，玻碳电极或经过修饰的玻碳电极作为工作电极，铂片电极作对电极，饱和甘汞电极（SCE）用作参比电极；紫外可见（UV-vis）光谱实验采用UV-8500型紫外可见分光光度计 （上海天美科学仪器有限公司）；PHS-3C精密pH计（上海雷磁仪器厂）；SK2200H超声仪 （上海科导超声仪器有限公司）；透射电子显微谱（TEM谱）由JEOL-JEM200CX型透射电镜得到。

1.3 纳米ZnO分散液的制备

纳米ZnO是根据文献[10]运用种子助长的化学反应法制备的。具体的实验制备方法是：称取1．335 g硝酸锌溶解在100mL的超纯水中，同时，称取0．63 g二亚乙基三胺溶解在100mL的超纯水中，搅拌30min后，将这两种溶液混合并加热，在500mL的烤箱中在95℃的条件下加热3 h。最后将得到的产品冷却、蒸馏水洗涤并晾干。这样就制得了粒径大约在10～20 nm左右的棒状的纳米ZnO。 取前面已制备好的纳米ZnO 25 mg放入盛有25mL超纯水的烧杯中，搅拌4 h使之充分溶解，然后过滤得1mg/mL的纳米ZnO分散液。

1.4 修饰电极的制备

玻碳电极先用细的金相砂纸打磨干净，然后用二次蒸馏水超声，再依次用0．3，0．05μm Al2O3粉末进行抛光。抛光后电极依次用二次蒸馏水、乙醇、和二次蒸馏水进行超声清洗。将上面制备好的1 mg/mL的纳米ZnO分散液与1．34×10-4mol/L的血红蛋白（Hb，pH7．0）溶液以体积比为1∶1的比例混合。然后将处理干净的玻碳电极浸泡在混合溶液中放置于冰箱 （4℃）中进行自组装20 h，制备ZnONRs-Hb/GCE修饰电极。作为对比，相同条件下，还制备了ZnONPs/GCE修饰电极和裸玻碳电极。

1.5 测量方法

取10 mL 0．067 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7．0）于反应池中，连接三电极系统，铂电极为对电极，饱和的甘汞电极为参比电极，修饰电极为工作电极。CV实验在静止溶液中操作。计时电流（CA）实验在搅拌溶液中操作，待基线电流稳定后，加入一定量的H2O2，记录响应电流值。

2 结果与讨论

2.1 TEM表征

图1是纳米ZnO分散液和纳米ZnO-Hb溶液的透射电镜图。从图1（a）中可以发现所制备的纳米ZnO是棒状的，粒径在10～20 nm左右，当ZnO分散液和Hb溶液以体积比1∶1混合后，Hb密集地包埋在棒状的纳米ZnO中，如图1（b）。

2.2 紫外可见吸收光谱

图1 纳米ZnO（a）和纳米ZnO-Hb（b）的透射电镜图Fig.1 TEM imagesof ZnONRs（a）and ZnONRs-Hb（b）

图2 不同溶液的紫外可见光谱图Fig.2 UV-visabsorption spectra of ZnONRs（A）、Hb（B）and ZnONRs-Hb（C）

图3 （A）不同修饰电极的循环伏安图；（B）ZnONRs-Hb/GCE修饰电极在磷酸缓冲溶液（pH7.0）中连扫50圈Fig.3 （A）Cyclic voltammograms（CVs）ofbare GCE（a）ZnONRs/GCE（b）ZnONRs-Hb/GCE（c）in PBS（pH7.0）.（B）Cyclic voltammograms（CVs）of ZnONRs-Hb/GCE in pH7.0 PBSsolutionwith 50 circles. Scan rateat200mV/s

图2是不同溶液的紫外可见光谱，棒状的纳米ZnO分散液在348 nm左右有最大吸收峰，如图2（A）。从图2（B）中，可以看到，血红蛋白（Hb）溶液的Soret带最大吸收峰出现在408 nm左右，另外，在Q带、CT带依次有500和640 nm两个吸收峰，说明血红蛋白保持着它原有的活性且二级结构保持完好没有破坏。当棒状的纳米ZnO分散液和Hb溶液混合后，最大吸收峰在408 nm左右，同时Q带、CT带依次有500，640 nm两个很弱的峰，如图2（C），这说明棒状的纳米ZnO分散液和Hb溶液混合后，相互作用结合在一起，同时血红蛋白仍然保持着它原有的活性且二级结构没有被破坏。

2.3 修饰电极的直接电化学行为

图3（A）是研究不同修饰电极在pH7.0的PBS溶液中的循环伏安曲线。图3（A）中（a）、（b）依次是裸玻碳电极、ZnONRs/GCE修饰电极的循环伏安曲线，都没有氧化还原峰。而ZnONRs-Hb/GCE修饰电极，如图3（A）中（c），可以很明显的看到有一对形状相似的氧化还原峰，这表明Hb实现了它与电极间的直接电子传递，反应如下：Hb（FeⅢ）+e=Hb（FeⅡ）。图3（B）是ZnO NRs-Hb/GCE修饰电极在pH7．0的PBS溶液中连续扫50圈的循环伏安曲线，可以看到，除了第一圈，氧化还原峰电位基本不变而且氧化峰电流也基本没变，这表明Hb比较牢固的固定在玻碳电极上。

2.4 修饰电极不同扫速的循环伏安曲线

图4（A）考察了不同扫描速度和氧化还原峰电流之间的关系，随着扫速的增大，氧化还原峰电流也逐渐的增大，但氧化还原峰电位基本不变。当扫速在100～600mV/s（a→f）间变化时，如图4（B）氧化还原峰电流与扫描速度成一次线性关系，表明这是一个表面控制的反应过程，即为薄层电化学行为。同时，也可以进一步说明Hb成功的固定到电极上并且实现了直接电子传递。

图4 （A）ZnONRs-Hb/GCE修饰电极在磷酸缓冲溶液（pH7．0）中不同扫速的循环伏安的曲线；（B）峰电流对扫速的线性关系Fig．4 （A）Cyclic voltammograms（CVs）of ZnONRs-Hb/GCE in pH7．0 PBSsolutionwith differentscan ratesof（from a to f）100,200,300,400,500,and 600mV/s．（B）A plotofpeak currents vs．scan rates

2.5 溶液pH的影响

图5 （A）ZnONRs-Hb/GCE修饰电极在不同pH磷酸缓冲溶液中不同扫速的循环伏安的曲线；（B）pH对式量电位EØ的线性关系图Fig．5 （A）Cyclic voltammogramsof ZnONRs-Hb/GCE in 0．05mol/LPBSsolutionwith different．pH:4．0,5．0, 6．0,7．0,8．0,9．0（from a to f）（B）A Plotof the formalpotentialsvs．pH values．Scan rate at200mV/s

用循环伏安法研究了溶液pH对修饰电极式量电位EØ的影响。图5（A）表明，修饰电极的循环伏安行为在很大程度上受到外部溶液pH值的影响，该反应是：HbFe（III）+H++e-⇌HbHFe（II），从图中可以看到，当底液的pH值改变时，修饰电极的循环伏安氧化还原峰电位随缓冲溶液pH值的增加而负移。在pH值在4．0～9．0（a→f）之间时，式量电位EØ与溶液的pH值呈线性关系，如图5（B），斜率是-52．7mV/pH，这一数值与伴随一个质子转移的单电子可逆电极反应的理论值-57．6mV/pH（20℃）相接近。当从pH9．0返回到pH4．0测定，得到的循环伏安图与之前的一致，说明该修饰电极有很好的稳定性和可逆性。

2.6 修饰电极对过氧化氢（H2O2）的催化

从图6插图中，可以看到，裸玻碳电极、ZnO/ GCE修饰电极对H2O2均没有催化还原作用。但ZnO NRs-Hb/GCE修饰电极对H2O2有明显的电催化还原作用，如图4-6（b→e）,随着H2O2浓度的增大，还原峰逐渐的增大而氧化峰逐渐减小甚至消失。这表明ZnONRs-Hb/GCE修饰电极对H2O2有良好的电催化还原作用，反应是：H2O2+ 2HbHFe（II）→2HbFe（III）+2H2O

图6 不同修饰电极在磷酸缓冲溶液（pH=6．9）中不含H2O2及含不同浓度的H2O2的循环伏安曲线，扫速:200mV/sFig．6 Cyclic voltammogramsof ZnONRs-Hb/GCEatscan rateof200mV/s in PBS（pH7．0）withoutH2O2（a）andwith 0．045mol/L ofH2O210μL（b）20μL（c）30μL（d）40μL（e）Inset:bare GCE（a）, ZnO/GCE atscan rate of200mV/s in 0．05mol/LPBS（pH7．0）withoutH2O2（b）and with 0．045mol/L of H2O2（c）

2.7 ZnO NRs-Hb/GCE修饰电极对过氧化氢（H2O2）的响应

图7是ZnO NRs-Hb/GCE修饰电极在恒电位-300mV时对不同浓度的H2O2的响应情况。从图7（A）中可以看出，ZnONRs-Hb/GCE修饰电极的响应电流随H2O2浓度的增大而增大，每次加入H2O2后，其响应电流在3 s内达到稳定，说明ZnONRs-Hb/GCE修饰电极对H2O2的响应速度快。通过实验结果计算得出，ZnONRs-Hb/GCE修饰电极对H2O2的响应的线性范围是1．06×10-6～7．82×10-3mol/L（r=0．996），检测限是8．86×10-7mol/L（S/N=3）。另外，根据图7（B）的线性关系图利用公式算得其Km是0．117mmol/L，表明修饰电极对H2O2的响应迅速而灵敏。

2.8 重现性和稳定性

该文还对ZnO NRs-Hb/GCE修饰电极的重现性和稳定性进行了研究。通过实验发现，4支ZnO NRs-Hb/GCE修饰电极在相同条件下对在PBS（pH7．0）溶液中对0．15mmol/L的H2O2的响应电流的相对偏差是1．9%左右，说明制备的生物传感器重现性好。同时，还考察了该修饰电极的稳定性。发现，ZnO NRs-Hb/GCE修饰电极在pH7．0的PBS溶液中在0到-0．8 V电位窗口下，以200mV/s的速度连续扫描50圈，氧化还原峰电位、响应电流基本没变，说明该修饰电极比较稳定。ZnONRs-Hb/GCE修饰电极在0．15mmol/LH2O2中测定后在4℃放置两周后，相同实验条件下对H2O2的响应电流是原来的96%，表明制备的生物传感器的重现性和稳定性都比较好。

图7 （A）ZnONRs-Hb/GCE修饰电极在10mL pH7.0 PBS溶液中计时电流曲线（工作电位：-300mV）（B）响应电流对H2O2浓度线性关系图Fig.7 （A）A typicalamperometric i–tcurveof ZnONRs-Hb/GCEat-300mV in 10mLPBS solutionwith pH7.0（B）A plotofsteady-state currentvs.H2O2concentration

3 结论

该文将高等电点棒状纳米ZnO分散液和低等电点的血红蛋白酶溶液混合，利用它们的等电点较大的差异性,在溶液中相互作用组装，然后再自组装修饰到玻碳电极上，制备了直接电子转移的生物传感器。制备过程简单，易操作，重现性高。对H2O2的响应迅速，有较宽的检测浓度范围、检测限低。

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ZnO-nanorods-based self-assembly in liquid phase for immobilization of hemoglobin and directelectrochem istry sensor

Zhang Qi,Duan Guo-ping,Guo Xiao-yu*,Yang Hai-feng*
(The Education Ministry Key Lab ofResource Chemistry,DepartmentofChemistry,ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234,China)

Self-assemblymethod could be used to synthesize nanomaterial-based biosensor by the help of polyelectrolyte such as poly(diallyldimethylammonium chloride)(PDDA)．However,polyelectrolyte resulted in severe aggregation ofnanomaterialsor damaging the bioactivity ofhemoglobin(Hb)．In addition,the processofpreparationwas relatively complicate and poor reproducibility．In thiswork,we developed a simplermethod that the ZnONPs sufficiently bound with Hb,taking advantage of the great difference of isoelectric pointbetween ZnONPs and Hb,and then self-assemblemethod wasused tomodify them on the cleaned glassy carbon electrode(GCE)．The directelectron transfer of Hb was realized on the as-prepared electrode．UV-vis Spectrophotometer,TEM and cyclic voltammetrywere used to characterize the synthesis processofbiosensor．The responses of H2O2were linearly proportional to the concentration from 1．06×10-6～7．82×10-3mol/L with a detection limitof8．86×10-7mol/L(S/N=3)．R．S．Dwas about l．9%foras-prepared electrodes in 0．15mmol/LH2O2in 0．05mol/LPBS(pH7．0)．Thisbiosensor exhibited the facile-made,good reproducibility and stability．

ZnO nanoparticles;hemoglobin;self-assembly;directelectron transfer

国家自然科学基金面上项目（21475088）

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