小尾寒羊和苏尼特羊CRH和POMC基因在繁殖相关组织中的差异性表达

周 梅，狄 冉，胡文萍，王翔宇，张效生，张金龙，刘秋月，储明星

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

遗传育种与繁殖

小尾寒羊和苏尼特羊CRH和POMC基因在繁殖相关组织中的差异性表达

周 梅1，狄 冉1，胡文萍1，王翔宇1，张效生2，张金龙2，刘秋月1，储明星1

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

为了探索CRH和POMC基因与绵羊季节性发情之间的关系，利用荧光定量PCR检测了两个基因在四季发情小尾寒羊和季节性发情苏尼特羊8个重要繁殖相关组织中的表达水平。结果表明：CRH在下丘脑和大脑中高表达；POMC在垂体中表达量最高，其次是下丘脑，在其他组织中均呈痕量表达，但小尾寒羊与苏尼特羊各组织间CRH和POMC基因的表达均无显著性差异（P＞0.05）。

绵羊；CRH；POMC；组织表达

绵羊季节性发情性状是制约其产业发展的重要因素之一，该性状受季节、光照、环境以及营养等多方面的影响，其中受季节影响最大。绵羊季节性发情的特点表现为春季不发情，夏、秋和冬季发情，这在一定程度上制约了绵羊产业的发展。我国除小尾寒羊和湖羊等少数常年发情绵羊品种外，绝大部分绵羊品种均表现出季节性发情的特点。因此，对影响绵羊季节性发情相关基因进行研究，对于提高绵羊繁殖效率、加快绵羊育种进程非常重要。

促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）是促肾上腺皮质激素释放激素因子家族成员之一［1］。CRH与垂体前叶的CRHR1结合之后能够激活下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitaryadrenalaxis，HPA），以对抗外界的应激［2］。CRH基因能够在小鼠的卵巢、子宫以及胎盘中表达，并且参与排卵和黄体退化等过程［3］。阿片黑素促皮质激素原（proopiomelanocortin，POMC）则是垂体促黑素激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞产生和分泌的多种功能蛋白，如α-促黑激素（α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）和促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）等的前体蛋白，与下丘脑-垂体-肾上腺轴控制的机体应激反应有关［4］，还能够抑制食物的摄入并降低体重，从而维持机体能量平衡［5］。

目前研究可知，CRH和POMC基因分别在哺乳动物的下丘脑和垂体中高表达［6］，而下丘脑和垂体对绵羊季节性发情相关激素如GnRH、FSH、LH等的分泌有着非常关键的调控作用，由此推测CRH和POMC基因很有可能与绵羊季节性繁殖有关。因此，本研究对CRH和POMC基因在小尾寒羊（常年发情）和苏尼特羊（季节性发情）8个组织间的表达差异进行了研究，以揭示其影响绵羊季节性发情的内在机制，为绵羊分子育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集和主要试剂

RNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司（北京），反转录试剂盒（PrimeScriptTMRTReagentKit）和荧光定量染料（SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ）均购于TaKaRa公司（大连）；Taq PCRMasterMix购于拓英坊科技有限公司（北京）。

1.2 组织总RNA的提取和检测

采用动物组织总RNA提取试剂盒（天根，北京）加Trizol（Invitrogen，美国）提取各组织总 RNA，并使用Nanodrop2000检测了提取RNA的浓度和OD值，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

1.3 引物设计

根据GenBank提供的绵羊CRH和POMC基因mRNA序列（登录号分别为：XM_015097787.1，XM_0121659-82.2），利用Primer Premier3.0软件进行跨外显子引物设计，以β-actin（NM_001009784）作为内参基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。引物名称和序列、退火温度以及扩增片段大小见表1。

表1 绵羊CRH和POMC基因的引物信息

1.4 cDNA合成

利用反转录试剂盒反转录合成cDNA，反转录体系总体积为20μL，需要量组成见表2。反转录反应条件：37℃15min，85℃5 s，获得cDNA第一链。全程操作在冰上进行。反转录产物进行5倍稀释，用持家基因β-actin进行PCR检测，将符合标准的cDNA置于-20℃保存，以用于检测目的基因的表达。

1.5 PCR反应

换届以来，机关各委室启动实施了“一委室一亮点”工程，每年重点抓好一项创新性工作，为机关建设创造条件、注入活力。

表2 反转录体系

PCR反应体系总体积为20μL，需要量组成见表3。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶检测PCR产物大小。

表3 PCR体系

1.6 实时荧光定量PCR

1.6.1 实时荧光定量PCR体系和程序 反应体系总体积为20μL，需要量组成见表4。PCR程序：95℃预变性5 s，95℃变性5 s，60℃30 s，40个循环；反应结束后对熔解曲线进行分析。

表4 实时荧光定量PCR体系

1.6.2 标准曲线的建立 将cDNA样本5倍稀释后，进行2倍梯度稀释获得5个浓度梯度（1、1/2、1/4、1/8、1/16）的cDNA样品。用这些cDNA作为模板对目的基因和持家基因进行荧光定量PCR，以浓度梯度的对数值（10为底数）为横坐标，以检测所得Ct值为纵坐标，绘制目的基因和持家基因标准曲线。

1.6.3 实时荧光定量检测与数据分析 荧光定量检测利用Roche LightCycler®480Ⅱ型荧光定量PCR仪进行，以β-actin为内参基因，每个样品重复检测3次。采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量，用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，用一般线性模型及最小显著差数（leastsignificantdifference，LSD）法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取与cDNA合成

利用1.2%琼脂糖凝胶电泳对RNA完整性进行检测，结果表明，RNA完整性良好，28S条带亮度大于18S且二者均无明显降解（图1），以反转录之后的cDNA为模板对CRH、POMC和β-actin进行PCR扩增，设计的CRH、POMC和β-actin三对引物扩增效果良好（图2），目的片段与预期的112、142和97 bp一致，且条带单一，可以用于后续的荧光定量试验。

图1 8个组织RNA电泳检测

图2 CRH、POMC和β-actin在8个组织中的PCR产物电泳检测

2.2 绵羊CRH基因和POMC基因在不同品种繁殖相关组织中的表达

运用荧光定量PCR对常年发情绵羊品种（小尾寒羊）和季节性发情绵羊品种（苏尼特羊）8个繁殖相关组织CRH基因和POMC基因的表达进行了检测，结果见图3。

图3 CRH和POMC基因在各组织中的表达水平

两个品种比较发现，CRH基因和POMC基因在两个绵羊品种中均表现出组织特异性表达的特点。其中，CRH在下丘脑和大脑中表达量最高，在其他组织中呈痕量表达，POMC基因在垂体中的表达量最高，其次是下丘脑，在其他组织中呈痕量表达，但小尾寒羊（常年发情）与苏尼特羊（季节性发情）各组织间CRH基因和POMC基因的表达均无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论与结论

CRH主要由下丘脑室旁核中的神经元分泌，能够刺激垂体前叶分泌ACTH，从而对肾上腺皮质的功能和发育进行调节［7］。POMC是ACTH的前体，它对于动物的代谢和生殖功能的维持非常重要，其分泌直接受到CRH的调控，ACTH的分泌方式为脉冲式，且释放的幅度和频率具有昼夜交替节律性［8］。褪黑激素（melatonin，MT）是由松果体分泌的一种胺类激素，其分泌也呈现出昼夜节律性［9］。研究表明，MT在绵羊季节性发情过程中扮演着非常重要的角色［10］。

CRH能够刺激POMC和ACTH的分泌，而ACTH与MT释放的频率和幅度在某种程度上呈现出相反的特点，MT又与绵羊的季节性发情存在密切关联，由此推测CRH和POMC基因很有可能与绵羊的季节性发情有关。

本研究通过提取同期发情后第7天（即黄体期）常年发情小尾寒羊和季节性发情苏尼特羊繁殖相关组织RNA，并用RT-PCR技术检测了CHR基因和POMC基因在大脑、小脑、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫体以及子宫角8个组织中的表达情况，发现CHR基因mRNA在下丘脑和大脑中高表达，在小脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫体和子宫角中呈痕量表达；POMC基因在垂体中的表达量最高，其次是下丘脑，在小脑、卵巢、输卵管、子宫体和子宫角中呈痕量表达。但小尾寒羊（常年发情）与苏尼特羊（季节性发情）各组织间CRH基因和POMC基因的表达均无显著差异（P＞0.05）。下丘脑和垂体是分泌多种与绵羊季节性繁殖相关生殖激素的关键组织，CRH和POMC分别在下丘脑和垂体中高表达初步揭示了二者在绵羊季节性繁殖中的重要位置。

本研究所选择的绵羊品种均处于黄体期，这也可能是导致CRH和POMC的表达量在常年发情小尾寒羊和季节性发情苏尼特羊之间无显著差异（P＞0.05）的原因，但从目前的实验结果可以看出，两个基因在常年发情小尾寒羊垂体和下丘脑中的表达均表现出高于季节性繁殖苏尼特羊的趋势，提示二者可能与季节性发情存在一定的联系。国外对绵羊季节性繁殖相关基因的表达研究也集中于下丘脑、垂体、子宫和卵巢，同时也会对不同时期及不同时间点之间的基因表达进行比较，并对相关生殖激素的分泌进行测定。而在本实验中，CRH和POMC在卵泡期的表达量因缺乏相关样品而无法得知，有待于进一步研究。至于二者在长日照或短日照不同时间点之间是否存在差异本实验室正在进行相关研究。本研究对于进一步探究CRH和POMC基因的功能及其与绵羊季节性发情之间的关系具有参考价值。

［1］ Subbannayya T，Balakrishnan L，Sudarshan G，etal.An integratedmap of corticotropin-releasing hormone signaling pathway［J］.Journal of CellCommunication and Signaling，2013，7（4）：295-300.

［2］ Graf C，Kuehne C，Panhuysen M，et al.Corticotropin-releasing hormone regulates common target geneswith divergent functions in corticotrope and neuronal cells［J］.Molecular&Cellular Endocrinology，2012，362（1-2）：29-38.

［3］ Kiapekou E，Zapanti E，Voukelatou D，et al.Corticotropin-releasing hormone inhibits in vitro oocyte maturation in mice［J］.Fertility& Sterility，2011，95（4）：1497-1499.

［4］ Jenks B G.Regulation of proopiomelanocortin gene expression：an overview of the signaling cascades，transcription factors，and responsive elements involved［J］.Annalsof the New York Academy of Sciences，2009，1163（1）：17-30.

［5］ King CM，Hentges ST.Relative number and distribution ofmurine hypothalamic proopiomelanocortin neurons innervating distinct target sites［J］.PLoSONE，2011，6（10）：e25864.

［6］ Manojlovic＇-Stojanoski M，Nestorovic＇N，Trifunovic＇S，et al.Dexamethasone exposure affects paraventricular nucleus and pituitary corticotrophs in female rat fetuses：An unbiased stereologicaland immunohistochemicalstudy［J］.Tissue&Cell，2016，48（5）：516-523.

［7］ Sautron V，Terenina E，Gress L，et al.Time course of the response to ACTH in pig：biologicaland transcriptomic study［J］.BMCGenomics，2015，16：961.

［8］ DengQ，Riquelme D，Trinh L，etal.Rapid glucocorticoid feedback inhibition of ACTH secretion involves ligand-dependentmembrane association ofglucocorticoid receptors［J］.Endocrinology，2015，156（9）：3215-3227.

［9］ LiY，Cassone VM.Clock-controlled regulation of the acute effects of norepinephrine on chick pineal melatonin rhythms［J］.Journal of BiologicalRhythms，2015，30（6）：519-532.

［10］Saxena V，Jha B，Meena A，et al.Assessment of genetic variability in the coding sequenceofmelatonin receptor gene（MTNR1A）in tropical arid sheep breeds of India［J］.Reproduction in Domestic Animals，2015，50（3）：517-521.

D ifferent Exp ression o f CRH and POMC Genes in Rep roductive Related Tissues in Sm all-tailHan Sheep and Sunite Sheep

Zhou Mei，Liu Qiuyue，Chu Mingxing，etal
（Key Laboratory ofAnimalGeneticsand Breeding and Reproduction ofMinistry ofAgriculture，InstituteofAnimalScience，Chinese Academy ofAgriculturalSciences，Beijing100193，China）

In order to explore the association of CRH and POMC with seasonalestrus in sheep,real-time PCRwasused to detect CRH and POMC mRNA expression in eight important reproductive related tissues.Year-round estrous Small-tailhan ewes and seasonalestrous Sunite eweswere selected as testanimals.The results showed that the expression of CRH was athigh level in hypothalamus and cerebrum，while POMC was the highest in pituitary，followed by hypothalamus.The expression levels were extremely low in all the other tissues for two genes.Both CRH and POMC expression had no significant differences between Small-tailhan ewesand Suniteewes（P＞0.05）.

sheep；CRH；POMC；tissueexpression

S826.2

A

2095-3887（2017）04-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.001

2017-05-05

国家自然科学基金项目（31472078，31402041，31572371，31501941，31501926）；国家肉羊产业技术体系专项（CARS-39）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（Y2017JC24，2013ywf-zd-1，2015ywf-zd-2，.2015ywf-zd-8）；中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-IAS13)；内蒙古自治区战略性新兴产业发展专项资金计划；宁夏农林科学院科技创新先导资金项目（DWJLC-2016001）

周梅（1988-），女，在读博士研究生，主要从事动物分子育种研究。

刘秋月，副研究员，博士；储明星，研究员，博士，博士生导师，主要从事羊优异繁殖性状的分子机理研究。