响应面法优化酶辅助提取佛手瓜总黄酮的工艺研究

蓝志福　陈建福

摘 要：为提高佛手瓜总黄酮提取率，采用酶辅助法对佛手瓜总黄酮的提取效果进行了研究。以总黄酮提取率为指标，研究了酶种类、酶用量、酶解温度、pH和酶解时间对总黄酮提取率的影响，在此基础上，利用响应面法对酶辅助提取佛手瓜总黄酮工艺条件进行了优化，建立了二次多项式模型，确定了最佳工艺条件。结果表明，在试验的4种酶中，以纤维素酶为水解酶的提取效果最好。纤维素酶辅助提取佛手瓜总黄酮的最佳工艺条件为：酶用量1.0%，酶解温度47℃，pH5.2，酶解时间46min，该条件下总黄酮提取率为3.802%，与预测值相比，相对误差为0.653%，表明回归模型所得数据与实验结果符合良好，验证了数学模型的有效性。该工艺与热浸提法相比，总黄酮的提取率提高了25.9%，为佛手瓜总黄酮的深度开发与利用提供了科学依据。

关键词：佛手瓜；总黄酮；酶辅助；响应面；优化

中图分类号 TQ28；S38；TS255；Q814 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）14-0020-06

Abstract：In this work the enzymes-assisted technology was used for extraction total flavonoids from Sechium edule（Jacq.） Swartz. The effects of enzymes types，enzyme amount，enzymolysis temperature，pH and enzymolysis time on the yield of total flavonoids were studied. The response surface method had been used to further optimize the extraction process by an establishment of quadratic polynomial regression equation for optimal extraction condition. The results showed that the cellulase was the best enzyme with the highest total flavonoids extraction yield，Furthermore，the optimal extraction conditions of total flavonoids were as follows： enzyme amount 1.0%，enzymolysis temperature 47 ℃，pH 5.2，enzymolysis time 46 min. The yield of total flavonoids was 3.802% and the relative error between the theoretic values （3.827%） and testing values （3.802%） was 0.653%，which indicated the obtained data were in good agreement with the experimental results and the feasible model fitted well with the experimental data. Meanwhile the extraction yield increased by 25.9% compared with the traditional extraction method. Results could provide scientific foundation for the exploitation and utilization of the total flavonoids in Sechium edule（Jacq.） Swartz.

Key words：Sechium edule（Jacq.） Swartz；Total flavonoids；Enzyme-assisted；Response surface methodology；Optimization

佛手瓜（Sechium edule（Jacq.）Swartz）又名拳頭瓜、万年瓜，为葫芦科佛手瓜属多年草本植物，佛手瓜味美可口、清脆多汁，是一种富含营养的珍稀蔬菜[1]。佛手瓜原产于西印度群岛、墨西哥一带，于20世纪初引入我国，由于其适应性强、高产质优、效益高，在我国的福建、广东、广西、云南等地区已广泛栽种[2]。佛手瓜不仅含有丰富的钙、铁、镁、锌等微量元素，还含有胡萝卜素、氨基酸、黄酮、多糖、果胶等天然功能性成分，是一种具有营养价值的药食两用保健蔬菜[3-4]。黄酮类化合物是植物花、叶、根中的多酚类物质，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂和预防心血管病等生理功能，可作为食品添加剂和功能性食品的原料，具有广阔的应用前景[5-7]。已有文献[8]报道了佛手瓜总黄酮的提取，文献中使用的乙醇浸提法简便易行，设备要求低，但提取效率较低。黄酮类物质主要存在于植物的细胞内，而细胞壁主要由纤维素构成，因此要使黄酮类物质从细胞内溶出到溶剂主体，必须先破坏植物的细胞壁或使细胞壁分解，才能有利于黄酮类物质的溶出[9]。本研究在文献报道的基础上，采用酶对佛手瓜进行酶解，以破坏其细胞壁，并对影响总黄酮提取率的因素进行了分析与优化，旨在为佛手瓜总黄酮的开发与利用提供理论依据。

1 试验条件与方法

1.1 试剂与仪器 乙醇，分析纯，汕头西陇化工股份有限公司，使用时，配制成不同浓度（体积分数）的乙醇溶液；氢氧化钠，分析纯，天津市北辰方正试剂厂；佛手瓜，购于漳州西洋坪菜市场。芦丁，标准品（UV≥98%），上海沪宇生物试剂公司；亚硝酸钠，分析纯，天津福晨化学试剂厂；硝酸铝，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；中性蛋白酶，食品级5万U/g，南宁东恒华道生物科技有限责任公司；纤维素酶，食品级5万U/g，江苏锐阳生物科技有限公司；α-淀粉酶，食品级5万U/g，湖南鸿鹰祥生物工程股份有限公司；果胶酶，食品级5万U/g，河南誉信诚生物科技有限公司。

采用上海美谱达仪器有限公司生产的UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计进行吸光度测试；采用北京四环科学仪器厂生产的LGJ10-C型冷冻干燥机进行冷冻干燥；采用上海冰都电器有限公司生产的Q-250B型高速多功能粉碎机对佛手瓜进行粉碎。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮标准曲线的绘制 利用硝酸铝—亚硝酸钠比色法[10]，以芦丁为标准品，对总黄酮标准曲线进行绘制。将芦丁标准品置于105℃的干燥箱中干燥至恒重，准确称取芦丁10mg，用80%乙醇定容至100mL的容量瓶中，得到100mg/L芦丁标准溶液。分别量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的芦丁标准溶液于10mL的容量瓶中，分别加入0.3mL5%NaNO2溶液，摇匀，放置6min后加入0.3mL10%Al（NO3）3溶液，摇匀，放置6min后再加4mL4%NaOH溶液，摇匀，放置20min后用80%乙醇定容，放置30min后分别测定其在510nm波长处的吸光度，以吸光度y为纵坐标，芦丁浓度x为横坐标，绘制标准曲线，将结果进行线性回归，得方程为y=0.0102x-0.0013，相关系数R2=0.9999。

1.2.2 佛手瓜总黄酮的测定 取一定量的提取液于10mL的容量瓶中，按上述方法加相应的试剂，同时作空白。测定在510nm处的吸光度，代入吸光度与浓度的回归方程，计算得到总黄酮浓度，用式（1）进行换算得总黄酮提取率。

佛手瓜总黄酮提取率（%）=[b×Vm×103×100] （1）

式中：m为佛手瓜的质量/g；b为回归方程计算的总黄酮质量浓度/（mg·L-1）；V为提取液体积/L。

1.2.3 热浸提取工艺 将佛手瓜洗净切成条状，并泡于蒸馏水中0.5h，捞起自然晾干后，冰冻，并于冷冻干燥机中进行干燥，粉碎，过80目筛备用。在装有冷凝管的250mL三口烧瓶中，装入一定量的佛手瓜粉末，按液料比20mL·g-1加入70%乙醇溶液，并于80℃恒温浸取2h，过滤，滤渣再重复提取2次，结束后，合并滤液，浓缩，定容，按1.2.2中的方法计算得到总黄酮提取率。

1.2.4 佛手瓜总黄酮酶辅助提取 在250mL的烧杯中准确加入佛手瓜粉末5g，加入75mL蒸馏水，搅拌混合均匀，加入所需要的酶，按工艺设定酶解时间、pH、酶解温度对佛手瓜粉末进行处理，处理完后，过滤并按1.2.3方法进行提取、计算得佛手瓜总黄酮提取率，并据上述方法，重复做3次平行实验，得佛手瓜总黄酮提取率的平均值。

1.3 響应面实验设计 在单因素实验的基础上，运用DesignExpert8.05b软件，以总黄酮提取率为响应值，据Box-Behnken试验设计原理，选取酶用量（A）、酶解温度（B）、pH（C）、酶解时间（D）为考察因素，建立了四因素三水平的响应面实验，实验因素与水平编码如表1所示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶种类对提取率的影响 选取不加酶（对照）、纤维素酶、α-淀粉酶、果胶酶和中性蛋白酶在液料比为15mL·g-1、酶用量1%（质量分数）、pH值和酶解温度为各酶适宜范围、酶解时间50min的条件下进行预处理，并按1.2.3进行佛手瓜总黄酮的提取，结果如图1所示。由图1中可以看出，加入酶后，佛手瓜中总黄酮的提取率增加。其中，纤维素酶使总黄酮的提取率增加最为显著，果胶酶次之，α-淀粉酶和中性蛋白酶的作用较弱，总黄酮的提取率提高较不明显。这是因为植物有效成分存在于由纤维素和果胶所构成的细胞壁内部，而纤维素酶和果胶酶能够水解细胞壁中的纤维素和果胶来破坏细胞壁，使细胞内的黄酮类物质能够充分释放。果胶酶对佛手瓜总黄酮的提取效果低于纤维素酶，说明佛手瓜中细胞壁上的果胶含量比纤维素含量低[11]；α-淀粉酶和中性蛋白酶的作用不明显，说明佛手瓜中淀粉和蛋白质的含量相对较少[12]。故选择纤维素酶为提取所用酶。

2.1.2 酶用量对提取率的影响 固定酶解温度50℃、pH5.0、酶解时间50min的条件下，考察了酶用量（0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%）对佛手瓜总黄酮提取率的影响，其结果见图2。

从图2中可以看出，佛手瓜总黄酮提取率随着酶用量的增加而增大，当酶用量为1.0%时，佛手瓜总黄酮的提取率达到最大，当酶用量超过1.0%后，总黄酮提取率又开始下降，这是因为随着酶用量的增加，酶与佛手瓜颗粒细胞壁上的底物作用越来越多，加快了酶与底物的催化反应，促进了黄酮类物质的溶出而使得提取率提高，而当酶用量过大时，过多的酶包裹着底物，阻碍了酶促反应，从而导致了黄酮类物质溶出的困难[13]。故选择酶用量为1.0%。

2.1.3 酶解温度对提取率的影响 固定酶用量1.0%、pH5.0、酶解时间50min的条件下，考察了酶解温度（40、45、50、55、60、65℃）对佛手瓜总黄酮提取率的影响，其结果见图3。从图3中可以看出，佛手瓜总黄酮提取率随着酶解温度的增加而增大，佛手瓜总黄酮在酶解温度为50℃时，提取率达到最大，继续增大酶解温度，提取率又逐渐下降，这是因为在较低温度时，酶解反应较为缓慢，随着酶解温度的升高，酶的活性增强，酶解反应加快，总黄酮提取率增大，而当温度过高时，酶会发生不可逆的变性而逐渐失活[14]，酶解能力下降，故选择酶解温度为50℃。

2.1.4 pH对提取率的影响 固定酶用量1.0%、酶解温度50℃、酶解时间50min的条件下，考察pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）对佛手瓜总黄酮提取率的影响，其结果见图4。从图4中可以看出，佛手瓜总黄酮提取率随着pH的增加而增大，当佛手瓜总黄酮在pH为5.0时，提取率达到最大，继续增大pH，总黄酮的提取率迅速下降。这是因为酶必须在适宜的pH范围内才能存活，过高或过低的pH都将影响酶的解离，甚至会使酶失去活性，而纤维素酶活性的降低将直接影响到对植物细胞壁的作用[15]，纤维素酶在pH=5.0时呈现了最大的活力，故选择pH为5.0。

2.1.5 酶解时间对提取率的影响 固定酶用量1.0%、酶解温度50℃、pH5.0的条件下，考察了酶解时间（30、40、50、60、70、80min）对佛手瓜总黄酮提取率的影响，其结果见图5。从图5中可以看出，佛手瓜总黄酮提取率随着酶解时间的增加而增大，当酶解时间在50min时，佛手瓜总黄酮提取率达到最大，超过50min后，提取率增加趋于缓慢。这是因为酶解时间较短时，酶与底物作用不充分，随着酶解时间的增加，酶与底物的作用更加充分，细胞壁破坏增强，促使佛手瓜总黄酮更容易地溶出而使得提取率增大，而当酶解时间超过50min后，细胞壁上的纤维素已被酶解殆尽[16]，酶解时间继续延长，已无法再大幅度增加提取率，故选择酶解时间为50min。

2.2 佛手瓜总黄酮提取工艺的响应面优化

2.2.1 回归模型及显著性检验 在单因素实验的基础上，以酶用量（A）、酶解温度（B）、pH（C）、酶解时间（D）为自变量，采用Box-Benhnken实验设计，总黄酮提取率为响应值，利用DesignExpert8.05b软件进行响应面分析，结果如表2和表3所示。

利用Design-Expert8.05b软件对表2实验结果进行多元回归分析，得到响应值与各工艺因素间的二次多项回归模型为：

Y=3.77+0.049A-0.1B+0.14C-0.057D+0.071AB-0.051AC+0.035AD-0.035BC+0.051BD+0.074CD-0.16A2-0.17B2-0.16C2-0.072D2，

从表3的方差分析可知，该回归模型极显著（P<0.0001），回归方程的相关系数R2=0.9473，说明该模型的响应值有超过94%的数据可以用来对实验数据进行解释，方程的拟合度好、可靠性高；P值为0.0916>0.05，失拟项F值4.14，失拟项不显著，说明该模型误差小，回归模型显著，拟合度较好，说明在所考察的工艺条件范围内可以用本模型来分析与预测。从P值及F值可以得到各工艺间的对总黄酮提取率的影响顺序为：pH>酶解温度>酶解时间>酶用量。二次项A2、B2、C2、D2，一次项B、C、D对试验结果影响极显著（P<0.01）；一次项A，交互项AB、CD对试验结果影响显著（P<0.05）；交互项AC、AD、BC、BD对试验结果影响不显著（P>0.05）。

2.2.2 响应面分析 根据响应面及等高线的形状，可以分析酶用量、酶解温度、pH和酶解时间对佛手瓜总黄酮提取率的影响并且可以得到最佳参数及各工艺因素之间的相互作用，根据回归方程绘制出响应面及，如图6所示，从图6（A）中可知，酶用量和酶解温度的交互作用显著，酶用量较小时，酶解温度对提取率的影响较大，随着酶解温度的增加总黄酮提取率迅速增大，而后总黄酮提取率又随着酶解温度的升高而降低；从图6（B）中可知，酶用量和pH的交互作用不显著，总黄酮提取率随酶用量的增大和pH的增加均呈现先增大后减小的趋势；从图6（C）中可知，酶用量和酶解时间的交互作用不显著，总黄酮提取率随酶用量的增大呈现先增大后减小的趋势，而总黄酮提取率随着酶解时间的延长呈现先增大后又趋于稳定的趋势；从图6（D）中可知，酶解温度和pH的交互作用不显著，总黄酮提取率随酶解温度的升高和pH的增加均呈现先增大后减小的趋势；从图6（E）中可知，酶解温度和酶解时间的交互作用不显著，总黄酮提取率随酶解温度的升高呈现先增大后减小的趋势，总黄酮提取率随着酶解时间的延长呈现先增大后又趋于稳定的趋势。从图6（F）中可知，pH和酶解时间的交互作用显著，随着pH的增大，总黄酮提取率先迅速增大，而后又迅速减小，随着酶解时间的增加，总黄酮提取率逐渐增大后趋于稳定；由响应面和等高线图以及分析可以看出，各工艺间的主次因素顺序为pH>酶解温度>酶解时间>酶用量。

2.2.3 最优条件的确定及验证试验 根据回归模型分析，得到佛手瓜总黄酮的纤维素酶辅助提取的最佳工艺条件为：酶用量1.0%、酶解温度47.90℃、pH5.21、酶解时间46.59min，该条件下总黄酮提取率的最大理论值为3.827%。为检测回归方程的可靠性，并考虑到实验操作的便利性，将最优条件修正为：酶用量1.0%、酶解温度47℃、pH5.2、酶解时间46min，并进行3次重复验证实验，得到佛手瓜总黄酮提取率为3.792%、3.806%、3.808%，平均值为3.802%，标准偏差为0.872%，与预测值相比，相对误差为0.653%，表明回归模型所得数据与实验结果符合良好，验证了数学模型的有效性。经过酶预处理后，与热浸提法相比[8]，佛手瓜总黄酮的提取率提高了25.9%，为佛手瓜总黄酮的深度开发与利用提供了科学依据。

3 結论与讨论

（1）植物有效成分主要存在于植物细胞内部，因此要使有效成分更多更快的溶出，必须破坏植物细胞壁。酶是专一而高效的催化剂，可以有效地破坏植物细胞壁上面的物质，从而增加细胞壁的通透性。通过实验发现，纤维素酶的对细胞壁的破坏效果最好，提取率最高，果胶酶次之，这与植物细胞壁主要由纤维素和果胶所组成的相符，因此采用纤维素酶来水解细胞壁上的纤维素，可以最大程度地破坏细胞壁，降低有效成分通过细胞壁的阻力，使植物细胞内的有效成分更多更快地溶出，获得最大的提取效果。

（2）以佛手瓜为原料，采用酶辅助法对佛手瓜总黄酮进行了提取，并在单因素实验的基础上，利用响应面法对纤维素酶辅助提取佛手瓜总黄酮的工艺进行了优化，建立了二次多项式回归模型。实验结果表明，在试验的4种酶中，纤维素酶对佛手瓜总黄酮的提取效果最好，纤维素酶辅助提取佛手瓜总黄酮的最佳工艺参数为：酶用量1.0%、酶解温度47℃、pH5.2、酶解时间46min，进行3次重复验证实验，得到佛手瓜总黄酮提取率的平均值3.802%，与预测值相比，相对误差为0.653%，表明回归模型所得数据与实验结果符合良好，验证了数学模型的有效性。经过酶预处理后，与热浸提法相比，佛手瓜总黄酮的提取率提高了25.9%，为佛手瓜总黄酮的深度开发与利用提供了科学依据。

参考文献

[1]Ordonez A A L，Gomez J D，Vattuone M A. Antioxidant activities of Sechium edule（Jacq.）Swartz extracts[J].Food Chemistry，2006，97（3）：452-458.

[2]Wu M C，Chen Y W，Hwang J Y，et al. Transacylation of citrus pectin as catalyzed by pectinesterase from tendril shoots of chayote [Sechium edule（Jacq.）Swartz][J].Food Research International，2004，37（8）：759-765.

[3]Siciliano T，De Tommasi N，Morelli I，et al.Study of flavonoids of Sechium edule（Jacq）Swartz（Cucurbitaceae）different edible organs by liquid chromatography photodiode array mass spectrometry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（21）：6510-6515.

[4]Fatemi F，Dini S，Rezaei M B，et al.The effect of γ-irradiation on the chemical composition and antioxidant activities of peppermint essential oil and extract[J].Journal of Essential Oil Research，2014，26（2）：97-104.

[5]Martinez-Perez C，Ward C，Cook G，et al. Novel flavonoids as anti-cancer agents：mechanisms of action and promise for their potential application in breast cancer[J].Biochemical Society Transactions，2014，42（4）：1017-1023.

[6]Kim J，Matsuba Y，Ning J，et al. Analysis of Natural and Induced Variation in Tomato Glandular Trichome Flavonoids Identifies a Gene Not Present in the Reference Genome[J]. The Plant Cell Online，2014，26（8）：3272-3285.

[7]Rodriguez-Mateos A，Vauzour D，Krueger C G，et al. Bioavailability，bioactivity and impact on health of dietary flavonoids and related compounds： an update[J].Archives of Toxicology，2014，88（10）： 1803-1853.

[8]杨海涛.佛手瓜黄酮类化合物提取工艺的优化[J].湖北农业科学，2008，47（4）：460-462.

[9]Haitao Y，Xiaoyan C A O.酶-超声辅助提取苦荞秆中总黄酮及抗氧化活性研究[J].中国酿造，2016，35（9）：72-76.

[10]陈建福，林洵，陈美慧，等. 响应面法优化超声辅助提取佛手瓜总黄酮的工艺研究[J].中国饲料，2015，26（16）：25-28.

[11]张慢，潘丽军，姜绍通，等.响应面法优化酶-超声波辅助同步提取紫薯花青素工艺[J].食品科学，2014，35（10）：23-28.

[12]Puri M，Sharma D，Barrow C J.Enzyme-assisted extraction of bioactives from plants[J]. Trends in Biotechnology，2012，30（1）：37-44.

[13]Candiracci M，Citterio B，Piatti E. Antifungal activity of the honey flavonoid extract against Candida albicans[J].Food Chemistry，2012，131（2）：493-499.

[14]Balasuriya N，Rupasinghe H P V.Antihypertensive properties of flavonoid-rich apple peel extract[J].Food Chemistry，2012，135（4）：2320-2325.

[15]Wang J，Cao F，Su E，et al. Improving Flavonoid Extraction from Ginkgo biloba Leaves by Prefermentation Processing[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（24）：5783-5791.

[16]Zhao Y M，Song J H，Wang J，et al. Optimization of cellulase-assisted extraction process and antioxidant activities of polysaccharides from Tricholoma mongolicum Imai[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2016，96（13）：4484-4491.

（責编：张长青）