棘球蚴病防控技术研究与应用

1病原学

棘球属（Echinococcus）在分类学上属于动物界，扁形动物门，绦虫纲，圆叶目，带科，就全球范围来说，目前已经确认的种类有细粒棘球绦虫（E. granulosus）、多房棘球绦虫（E. multilocularis）、石渠棘球绦虫（E. shiquicus）、少节棘球绦虫（E. oligarthra）、伏氏棘球绦虫（E. vogeli）和其他从细粒棘球绦虫种里面新分出来的种。

细粒棘球绦虫种内变异现象突出，最初根据线粒体cox1和nad1基因核苷酸序列的差异可将细粒棘球绦虫分为10个基因型（G1～G10）以及狮株。在分子生物学方法广泛使用之前，人们把细粒棘球绦虫种内的变异体称为虫株（strain）。虽然虫株的概念在分类学属非正式术语，但是它在实际工作中经常被人们所采用。不同虫株其形态学特征、宿主特异性、流行范围、致病性等不尽相同。不同虫株和基因型之间非常吻合，并且把G1～G10，再加上狮株统称为细粒棘球绦虫广义种（E. granulosus sensu lato）。G1和G6的nad1基因核苷酸序列比较表明，差异性超过10%，差异明显。根据线粒体基因组序列构建的棘球属绦虫分子种系系统发生树（图1）来看，公认的种至少有9个，其中还有可能从加拿大棘球绦虫（E. canadensis包括G6～G10）中再划分出1～2新种，这是目前为止棘球属绦虫最为完整的分类学情况。因此，有必要对棘球属绦虫现有的分类地位进行修正或修订，即建议将细粒棘球绦虫G1～G3（分别为普通绵羊株、塔斯马尼亚绵羊株和水牛株）称为细粒棘球绦虫狭义种（E. granulosus sensu stricto），G4（马株）新设为马棘球绦虫（E. equinus），G5（牛株）新设为奥氏棘球绦虫（E. ortleppi），G6～G10（分别为骆驼株、猪株、鹿株、波兰株和芬诺斯堪迪亚鹿株）新设为加拿大棘球绦虫，狮株新设为猫或狮棘球绦虫（E. felidis）[1-3]。

2诊断技术

2.1中间宿主———棘球蚴感染的诊断

主要是针对中间宿主———棘球绦虫幼虫的诊断。目前对患棘球蚴病的中间宿主的生前诊断尚无行之有效的方法，现普遍采用国际公认的剖检法，对家畜宰后进行棘球蚴感染的调查，该法取得的调查结果为“金标准”，但对可疑病灶或包囊、一种宿主可感染多种棘球蚴等情况下有时无法做出准确鉴定。生前诊断方法包括影像学（如X线透视/B超）和免疫学方法（如皮试、ELISA和IHA等血清学方法），其中影像学技术在筛选实验动物或针对特别珍贵的动物时才使用。剖检法包括宰后肉眼观察、实验室诊断（如镜检和PCR、RFLP-PCR、RPA等分子生物学方法）。

针对中间宿主棘球蚴感染的诊断，笔者所在的研究小组已分离筛选到棘球蚴囊液中极具应用价值的抗原成分，并制备了相应包虫病检测试剂盒。检测表明，试剂盒对200份经剖检和分子生物学确认的包虫病羊血清检测时，阳性检出率为83%；检测840份阴性羊血清时，阴性检出率为97.2%。期望该试剂盒能用于羊棘球蚴感染的生前诊断和流行病学调查。

2.2终末宿主———棘球绦虫感染的诊断

主要是针对终末宿主（犬科动物）———棘球绦虫成虫的诊断。生前诊断方法包括从小肠或粪便中查出成虫、虫卵与节片的顯微镜检测法和槟榔碱泻下法（抽样调查），以及粪DNA检测法（LAMP、RPA、PCR等）、粪抗原ELISA法。剖检法用于抽样调查和作为评价其他方法的“金标准”。对于终末宿主即犬科动物的检测，现在国际上仍普遍采用氢溴酸槟榔碱泻法和剖检法。粪抗原ELISA方法有其优点与不足，优点是检测简便，可以进行批量检测；不足之处是敏感性低，目前市面上的试剂盒只针对细粒棘球绦虫（狭义种）的感染，而不能对多房棘球绦虫感染进行检测或诊断，另外，对样品新鲜度要求较高。

中华人民共和国农业行业标准《动物棘球蚴病诊断技术（修订）》，增加了一些较为成熟的分子生物学方法与技术，例如PCR、PCR-RFLP、基因型分析等，为棘球绦虫虫种与虫株（基因型）、可疑包囊的准确鉴定、检测或诊断等提供了新的工具。增加了终末宿主棘球绦虫感染剖检方法、粪便检查方法、粪抗原检测和粪DNA检测等方法，为传染源———犬等终末宿主流行病学调查与控制效果评价等提供了重要手段。

3流行病学调查

笔者开展了CE（囊型、单房型）流行病学调查和AE（泡型、多房型）流行病学调查。

3.1棘球蚴的宿主分布

细粒棘球绦虫的终末宿主是犬、狼和豺等食肉动物；中间宿主是羊、牛、骆驼、猪和鹿等偶蹄类动物，偶可感染马、袋鼠、某些啮齿类、灵长类和人。多房棘球蚴常见的终末宿主是狐，其次是狗、狼、獾和猫等。多房棘球蚴主要寄生在野生啮齿类动物如田鼠、麝鼠、旅鼠、仓鼠、大沙鼠、小家鼠以及褐家鼠体内。石渠棘球绦虫的终末宿主是藏狐，中间宿主主要为高原鼠兔，到目前为止，还未在藏狐和高原鼠兔以外的动物体内发现有石渠棘球绦虫（蚴）的寄生。

3.2广义细粒棘球绦虫在中国流行情况

G1分布广泛，家畜和人均可以感染；少量G3、G6、G7、G10人体病例分布在四川、新疆、黑龙江等地。少量G3、G6、G10病例也存在于青藏高原的牦牛和绵羊中。

3.3野生动物棘球蚴感染调查结果

野生动物多房棘球蚴感染调查结果显示，中间宿主为田鼠，久治县的感染率为43.6%（41/94），达日县的感染率为3.3%（5/151）。野生动物石渠棘球蚴感染调查结果显示，中间宿主为鼠兔，久治县的感染率为7.5%（3/40），达日县的感染率为14.3%（20/140）。某些区域野生动物棘球蚴感染率超过10%，说明棘球蚴的流行严重，与这些区域人棘球蚴病感染率高相吻合，因此，野生动物棘球蚴感染率可以作为人棘球蚴病感染状况的一个生物指标，或者说野生动物可作为棘球蚴病流行病学调查的“哨兵”动物而使用。endprint

3.4疫区犬粪样品检测结果

对疫区犬粪样品用LAMP进行棘球绦虫感染检测，结果显示：①从细粒棘球绦虫感染检测结果来看，达日县的感染率为12.7%，久治县的感染率为20.0%；②从多房棘球绦虫感染检测结果来看，达日县的感染率为12.7%，久治县的感染率为33.3%。

4防控技术

4.1切断传播途径

切断病原在犬—家畜之间的传播链，对动物进行驱虫和使用疫苗免疫，禁止荷有包虫的动物脏器随意抛弃和喂犬，在屠宰场实行严格检疫制度，对废弃脏器进行无害化处理。

4.2疫苗技术与应用

预防犬的棘球绦虫感染疫苗研究尚处于初期阶段，需要进一步加大研发力度。预防羊和牛棘球蚴病的疫苗已取得突破性成就，并进入推广应用阶段。

4.3中国国家包虫病免疫计划

我国对包虫病免疫计划的进程经历了以下几个阶段：①农业部文件（农医发[2014]10号），常见动物疫病免疫推荐方案（试行）首次将包虫病列为免疫病种之一；②农业部文件（农医发[2016]10号），国家动物疫病强制免疫计划：在包虫病重疫区，由省级畜牧兽医主管部门会同有关部门根据监测情况自主选择免疫的策略；③农业部文件（农医发[2017] 8号），国家动物疫病强制免疫计划，在包虫病流行区对新补栏羊进行包虫病免疫，群体免疫密度常年保持在90%以上，应免疫动物免疫一度达到100%。

5基因工程技术生产EG95重组抗原疫苗

基因工程技术生产EG95疫苗抗原的技术路线主要有两种表达系统：①大肠杆菌表达系统；②毕赤酵母表达系统。两种表达系统生产重组抗原方面的比较如下：①现有的基因工程疫苗，利用大肠杆菌表达系统生产EG95保护性抗原，产物为融合蛋白，呈包涵体形式表达，重组抗原不溶，需要复性，抗原难以维持天然蛋白构像，无糖基化修饰作用，免疫效果较好，但目的蛋白不易纯化，制苗工艺复杂；②正在研制的新型基因工程疫苗，利用毕赤酵母表达系统生产EG95保护性抗原，产物呈分泌性表达，重组抗原可溶，抗原能维持天然蛋白构象，有糖基化修饰作用，预期免疫效果更好，培养上清中蛋白表达量可达2g/L，目的蛋白纯度在90%以上，无需纯化，制苗工艺简单[3]。

已有大量文献报道，基因工程亚单位重组疫苗（EG95）在绵羊和牛进行二免后可使免疫动物产生坚强的抵抗棘球蚴感染的保护力（80%以上），基因工程亚单位重组疫苗（EG95）已在中国、阿根廷等国家推广使用。Gauci等[4]报道，小鼠试验证明，抵抗多房棘球蚴原发感染的免疫保护力为78.5%和82.9%。李建秋[5]对小鼠进行His-EM95+常规免疫，结果表明抵抗多房棘球蚴继发感染的免疫保护力为60.52%～67.38%。

6人用疫苗研发

包虫病流行区约6，000万人口受到被感染的危险，数百万人至近千万人为高危人群，因此应该考虑在高危人群使用疫苗进行预防。疫苗需要符合人用质量标准，通过筛选适宜佐剂、优化EG95蛋白纯化工艺和糖基化表达条件即可实现。研究EG95+EM95雙价疫苗最为理想。

7小结

科技部和卫计委于2017年6月6日联合下发了“十三五”重点研发项目申报指南，其中把包虫病人用疫苗的开发已列入研发内容，这无疑对推动棘球蚴病疫苗的深入研发注入了新活力。笔者所在研究小组的工作有幸得到了多个项目资金的大力支持，同时，特别感谢青海、宁夏、甘肃、新疆等省区动物疫控部门、疾病控制部门、高校等同行对笔者工作的大力支持和帮助。笔者组织国内包虫病知名专家，共同协作，在2015年出版了《棘球蚴病》专著，把这些年来国内外在包虫病研究和防控工作中所取得的研究成果和经验进行了系统归纳和总结，期望给包虫病防控工作提供重要参考资料和强有力支撑。

参考文献

[1]李立，娄忠子，闫鸿斌，等.棘球属绦虫分子种系发生研究进展[J].中国人兽共患病学报， 2014， 30（1）： 1155-1162.

[2]Thompson RC. Biology and Systematics of Echinococcus [J]. Adv Parasitol， 2017， 95： 65-109.

[3]Lymbery AJ. Phylogenetic Pattern， Evolutionary Processes and Species Delimitation in the Genus Echinococcus [J]. Adv Parasitol， 2017， 95： 111-145.

[4]贾万忠，娄忠子，李宏民，等.细粒棘球蚴EG95蛋白的修饰及在酵母中的表达[P].中国专利， 102731641B， 2014-12-24.

[5]Gauci C， Merli M， Muller V， et al. Molecular cloning of a vaccine antigen against infection with the larval stage of Echinococcus multilocularis[J]. Infection and Immunity， 2002， 70（7）： 3969-3972.

[6]李建秋.多房棘球蚴Em95基因克隆、原核表达及应用[D].中国农业科学院， 2015.endprint