DSCR4基因在母胎间的甲基化差异及其临床价值

麻妙艳,乞艳华,周 琦,邬晋芳,周 妮,闫桂花

(1西安交通大学第二附属医院超声科,西安 710004;2西安交通大学第二附属医院妇产科;*通讯作者,E-mail:wjf2yuan@126.com)



DSCR4基因在母胎间的甲基化差异及其临床价值

麻妙艳1,乞艳华1,周 琦1,邬晋芳2*,周 妮2,闫桂花2

(1西安交通大学第二附属医院超声科,西安 710004;2西安交通大学第二附属医院妇产科;*通讯作者,E-mail:wjf2yuan@126.com)

目的 探讨孕妇外周血中游离胎儿DSCR4基因的母胎甲基化差异,分析u-DSCR4基因的含量与孕周的相关性。 方法 共收集研究对象外周血样本76例(包括健康未妊娠组10例,正常早、中、晚妊娠组各12例,唐筛高危组20例,正常产后10例),用甲基化特异性PCR方法扩增DSCR4基因,定性检测在各组中的扩增情况,用实时荧光定量PCR扩增方法进行定量检测,分析各组中的u-DSCR4基因的含量变化。 结果 未妊娠组均未检出u-DSCR4基因;正常妊娠组u-DSCR4基因检出率为72.2%。中期妊娠、晚期妊娠组其含量分别是早期妊娠的1.75倍、2.50倍。孕有不同性别胎儿的母体血浆中u-DSCR4基因含量无显著性差异。唐氏血清学筛查高危组u-DSCR4基因检出率为75%,其含量是正常中期妊娠组的2.95倍。超声筛查异常组u-DSCR4基因检出率为75%,其含量与正常早期妊娠组相比较无明显差异。 结论 DSCR4基因是具有母胎表观遗传学差异的可靠胎儿特异性标志物,其含量随孕周的增加而升高、与胎儿性别无关,在唐氏血清学高危组有增高趋势。

DSCR4； 甲基化; 唐氏综合征

人类常见染色体异常疾病中,21三体综合征发病率较高,在活产儿染色体病中占70%[1],本文选取唐氏综合征关键区域(Down’s syndrome critical region,DSCR)具有母胎甲基化差异的DSCR4基因为目的基因[2],在胎儿组织中呈低甲基化状态(表示为u-DSCR4),而在相应的母体自身组织中呈高甲基化状态(表示为m-DSCR4),探索21三体发生潜在风险预测的表观遗传学标记,进行有关孕妇外周血中u-DSCR4基因含量研究,希望能为唐氏综合征的产前诊断提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2016-03～2016-09就诊于本院的正常妊娠妇女36例,唐氏综合征筛查高危孕妇20例,10例健康未妊娠女性志愿者,10例正常产后48 h健康妇女。所有研究对象均无内外科及肿瘤相关疾病,年龄<35岁,体质量<100 kg。入组标准:①妊娠组:首次、单胎妊娠,自然受孕,无妊娠并发症;②健康未妊娠组:无孕产史;③产后组:首次妊娠,正常分娩。本研究已取得所有研究对象的知情同意及医院伦理委员会认可。将各组平均年龄进行单因素方差分析,差异不显著,各组间差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

表1 各组研究对象的年龄和孕周比较

Table 1 Comparison of age and gestational weeks among different subjects

分组n平均年龄(岁)平均孕周(周)未妊娠1026.67±1.67正常妊娠 早期1226.44±3.5311.15±0.36 中期1226.80±3.0516.20±1.74 晚期1225.90±4.0038.40±1.43唐筛高危组 血清学筛查1227.33±3.6316.50±1.52 超声筛查826.33±2.0611.28±0.05产后48h健康1027.33±4.65

1.2 方法

1.2.1 超声筛查 使用GE Voluson E8彩色多普勒超声诊断仪,选用二维凸阵探头,频率为2-5 MHz,检测孕早期11-13+6周孕妇胎儿颈项透明层(nutral translucency,NT)厚度,采用NT大于3 mm为筛查异常的阳性切断值[3]。

1.2.2 血清筛查 采用孕中期二联血清学筛查方法进行筛查,以AFP+β-HCG为母体筛查标记物,使用Au-toDELFIA自动时光分辨检测系统,试剂盒来源于PerkinElmer公司,采用LifeCycle统计软件处理分析,以大于1/270为阳性切断值[4,5]。

1.2.3 DSCR4检测方法 分别抽取各组研究对象肘静脉血2 ml,用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取DNA,DNA经亚硫酸氢盐处理,甲基化特异性PCR扩增,扩增体系及条件控制严格按照常规PCR要求进行,分别扩增u-DSCR4基因、m-DSCR4基因、β-actin基因(内参基因),引物按照参考文献[6]设计,扩增产物电泳后观察,判断此两种基因在各组中的扩增情况。

以亚硫酸氢盐处理后的血浆DNA为模板,应用染料型SYBR Green I-实时荧光定量PCR定量[7,8]检测各妊娠组目的基因u-DSCR4的含量,β-actin为内参基因,扩增体系及条件控制严格按照实时荧光定量PCR要求进行。结果判定使用Delta-delta Ct相对定量法。

1.3 统计学处理

计算公式如下:ΔCt=Ct目的基因u-DSCR4-Ct内参基因β-actin；ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组；2-ΔΔCt=各组目的基因相对于对照组目的基因含量的倍数。

2 结果

2.1 定性结果

各组常规PCR产物电泳结果显示在所有孕妇外周血中均存在u-DSCR4和m-DSCR4两个基因条带,即既包含非甲基化状态,也包含高甲基化状态;而在所有健康未孕及产后48 h健康妇女外周血中仅出现m-DSCR4一种基因条带,即仅存高甲基化状态。提示DSCR4基因在胎儿组织中呈低甲基化状态,而在相应的母体自身组织中呈高甲基化状态。亚硫酸氢盐处理后健康未孕妇女、正常妊娠妇女、产后48 h健康妇女血浆u-DSCR4、m-DSCR4基因的扩增产物电泳结果见图1。

1.健康未孕妇女u-DSCR4基因的扩增;2.健康未孕妇女m-DSCR4基因的扩增;3.正常妊娠妇女u-DSCR4基因的扩增;4.正常妊娠妇女m-DSCR4基因的扩增;5.产后48 h妇女u-DSCR4基因的扩增;6.产后48h妇女m-DSCR4基因的扩增;7.阴性对照图1 各组甲基化特异性PCR产物电泳结果Figure 1 Electrophoresis results of amplification products by methylation specific PCR

2.2 定量结果

10例健康未妊娠女性志愿者及10例产后48 h健康妇女样本中均未扩增出目的基因u-DSCR4,但内参基因β-actin均见扩增,即目的基因不存在于健康的未妊娠妇女及产后妇女体内。

36例正常妊娠孕妇外周血中有26例检出u-DSCR4基因,检出率为72.2%。孕中、晚期孕妇外周血中u-DSCR4基因检出量与早期妊娠相比较其差异具有显著性,中期妊娠u-DSCR4基因的含量是早期妊娠的1.75倍,晚期妊娠u-DSCR4含量是早期妊娠的2.50倍(见表2)。

表2 正常早、中、晚妊娠组u-DSCR4基因相对定量数据

Table 2 Comparison of relative quantification of u-DSCR4 gene among early,medium and late pregnancy groups

组别n阳性平均ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt早期妊娠1279.38±1.350.00±1.35-中期妊娠12108.57±1.19-0.81±1.191.75晚期妊娠1298.06±0.89-1.32±0.892.50

随访出生后胎儿性别,共计男性胎儿17例,女性胎儿14例,失访5例,在未失访31例患者中u-DSCR4基因检出者共20例,其中男胎12例,女胎8例,假设其他因素相同的条件下将性别因素作为研究因素,发现孕有不同性别胎儿的母体血浆中u-DSCR4基因含量无显著性差异(见表3)。

表3 正常妊娠孕男性胎儿、女性胎儿组u-DSCR4基因相对定量数据

Table 3 Relative quantification of the u-DSCR4 gene in plasma of mothers with male or female fetuses

组别n阳性平均ΔCtP孕男胎组17128.61±0.38>0.05孕女胎组1488.59±0.50

12例唐氏综合征筛查高危患者检出u-DSCR4基因者9例,其u-DSCR4基因的含量是正常中期妊娠组含量的2.95倍(见表4)。

表4 正常中期妊娠组和血清学筛查高危组u-DSCR4基因相对定量数据

Table 4 Relative quantification of the u-DSCR4 gene in medium-term pregnancy and serologic screening high-risk pregnancy

组别n阳性平均ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt中期妊娠12108.57±1.19-0.81±1.19—血清学高危1297.01±0.54-1.56±0.542.95

8例超声检查结果异常患者检出u-DSCR4基因者6例,其u-DSCR4基因的含量与正常早期妊娠组含量相比较无明显差异。

表5 正常早期妊娠组和超声检查异常组u-DSCR4基因相对定量数据

Table 5 Relative quantification of the u-DSCR4 gene in early pregnancy and ultrasound abnormal pregnancy

组别n阳性平均ΔCtP早期妊娠1279.38±1.35>0.05超声检查异常868.50±0.42

3 讨论

表观遗传改变是细胞内除基因组外的遗传物质发生改变,基因型未变而表型却发生变化,DNA甲基化修饰是表观遗传的重要形式之一。近年来随着表观遗传学的不断发展,2008年Chim等[9]系统研究了21号染色体上具有母胎甲基化差异的标志序列,据此可以将母体外周血中来源于21号染色体的游离DNA片段加以区别,即能将胎儿DNA从母体DNA背景中区别出来。本实验中20例非妊娠状态女性组均未扩增出u-DSCR4基因,仅扩增出m-DSCR4基因,而妊娠组扩增出两条基因条带,证实了u-DSCR4基因做为胎儿特异性的标志是可靠的,是胎儿特有的具有母胎表观遗传学差异的标志物,并且产后清除很快,不受前次妊娠的影响,在判断本次妊娠中具有重要价值。

本实验共收集正常妊娠孕妇标本36例,其中早、中、晚期妊娠各12例。目的基因相对定量显示中期妊娠、晚期妊娠组u-DSCR4的含量分别是早期妊娠的1.75倍,2.5倍,表明正常孕妇血浆中u-DSCR4基因的检出量随妊娠进展表现出升高趋势,随着妊娠进展,游离胎儿DNA含量随之增多。本实验不能提供妊娠周数与游离胎儿DNA含量具有线性关系的证据,如若采用绝对定量法进行检测,则可能解决这个问题。绝对定量法须获得目的基因u-DSCR4标准品,以精确计算目的基因u-DSCR4的拷贝数,绘制出标准曲线。目前研究孕妇外周血中游离胎儿DNA含量与孕周的关系多采用横断面研究方法,即样本来源于同一妊娠阶段的不同孕妇,若能够监测同一孕妇在不同妊娠阶段外周血中游离胎儿DNA的含量,将能够更有力地证明孕妇外周血中游离胎儿DNA含量与妊娠时期的关系。

DSCR4基因位于21号染色体上,故其含量可判断胎儿21号染色体数目是否存在异常。本实验中唐氏血清学筛查高危组目的基因u-DSCR4含量较正常中期妊娠组明显升高,提示u-DSCR4基因有望成为胎儿特异性标志物进行21-三体的产前诊断,但在母体血浆中的含量与唐氏综合征的相关性有待于大样本随访染色体核型分析结果进行进一步证实。

研究发现NT增厚与胎儿染色体异常引起的颈后皮下液体积聚有关,对胎儿染色体异常等有较好的预测价值[10],但是也有研究表明即使胎儿染色体正常,也可能出现NT值的异常情况[11]。本研究中超声异常组孕妇外周血浆中u-DSCR4基因与正常妊娠组相比较并未发现有显著差异,提示超声异常并非唐氏综合征筛查的特异性指标,但因样本量较小,有待于大样本实验进行证实。

综上所述,本研究表明DSCR4基因是具有母胎表观遗传学差异的可靠胎儿特异性标志物,其含量随孕周的增加而升高、与胎儿性别无关,在唐氏综合征高危组有增高趋势。近年来母体外周血中胎儿游离DNA的含量与妊娠相关疾病备受学者关注,但有关DSCR4基因研究的相关报道甚少,目前21号染色体上已发现具有母胎甲基化差异的基因包含AIRE,POTE及DSCR4基因,迄今为止没有DSCR4基因含量研究的相关报道。孕妇外周血中u-DSCR4与唐氏综合征的特征性表型尤其是智力低下有密切关联[12],但是如何导致唐氏综合征特征性表型的机理尚不明了,我们期待有关DSCR4基因的研究有突破性的进展。

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Methylation difference of DSCR4 gene between maternal and fetal and its clinical value

MA Miaoyan1,QI Yanhua1,ZHOU Qi1,WU Jinfang2*,ZHOU Ni2,YAN Guihua2

(1DepartmentofUltrasound,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:wjf2yuan@126.com)

ObjectiveTo investigate the methylation difference of DSCR4 gene between maternal and fetal,and analyze the correlation of u-DSCR4 gene content with the gestational age.MethodsSeventy-six subjects were collected according to the standard,including 10 healthy non-pregnant women,12 normal pregnant women of early pregnancy,12 normal pregnant women of medium pregnancy,12 normal pregnant women of late pregnancy,20 patients with high risk Down’s syndrome,10 women at postpartum 48 h.Methylation specific PCR was used to amplify the u-DSCR4 and m-DSCR4 genes.Real-time quantitative PCR was used to analyze the content of the u-DSCR4 gene and its influencing factors in each group.Results①The u-DSCR4 gene was not detected in non-pregnant women.In normal pregnancy,the detection rate of the u-DSCR4 gene in plasma was 72.2%.The concentration of the u-DSCR4 gene in the medium-term and third-trimester pregnancy was respectively 1.75 times and 2.50 times of early pregnancy.The concentration of the u-DSCR4 gene was not affected by the sex of the fetus.The detection rate in paitents with high serology screening risk of Down’s syndrome was 75%,and the concentration was 2.95 times of the medium-term pregnancy.The concentrations of the u-DSCR4 gene in patients with ultrasound abnormalities had no significant difference from that of the first-trimester pregnancy.ConclusionThe u-DSCR4 gene is a reliable specific marker of fetal with epigenetic differences.Its concentration increases with the time of pregnancy and is also higher in patients with high serology screening risk of Down’s syndrome,and has nothing to do with fetal sex.So it can be used in prenatal genetic diagnosis.

DSCR4; methylation; Down’s syndrome

陕西省社会发展科技攻关基金资助项目(2015SF126,2016SF014)

麻妙艳,女,1986-03生,硕士,医师,E-mail:miaoyanma@126.com

2016-12-29

R596.1

A

1007-6611(2017)04-0374-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.016