SMYD2在反复自然流产患者子宫内膜蜕膜化中的作用及机制

杨 慧,张昌军* ,刁红录

(1武汉大学中南医院妇产科,武汉 430071;2湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心;*通讯作者,E-mail:542690700@qq.com)



SMYD2在反复自然流产患者子宫内膜蜕膜化中的作用及机制

杨 慧1,2,张昌军1,2*,刁红录2

(1武汉大学中南医院妇产科,武汉 430071;2湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心;*通讯作者,E-mail:542690700@qq.com)

目的 探讨SMYD2在反复自然流产(RSA)患者子宫内膜基质细胞和蜕膜化细胞中的表达及其对P53、LIF的调节作用。 方法 将正常人和RSA患者子宫内膜基质细胞进行体外诱导蜕膜化处理,并分为空白组、蜕膜化组、蜕膜化+抑制剂组,采用real-time PCR检测LIF、SMYD2、TRP53 mRNA,细胞免疫化学法检测SMYD2、P53、P-P53蛋白在子宫内膜蜕膜化细胞的表达及SMYD2特异性抑制剂AZ505对其表达的影响。 结果 在正常人和RSA患者蜕膜化组中,SMYD2、TRP53 mRNA表达均较空白组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。在正常人和RSA患者蜕膜化+抑制剂组中,LIF mRNA的表达比蜕膜化组增加,TRP53 mRNA的表达比蜕膜化组降低,且差异均有统计学意义(P<0.05),而SMYD2 mRNA与蜕膜化组差异无统计学意义。细胞免疫化学结果可见,正常人和RSA患者蜕膜化组细胞中SMYD2、 P53和P-P53蛋白信号均较空白组减弱,SMYD2抑制剂AZ505组正常人和RSA患者细胞中SMYD2、P53和P-P53蛋白信号均较蜕膜化组减弱。 结论 SMYD2通过对P53和LIF的调节作用而参与反复自然流产患者子宫内膜蜕膜化过程。

SMYD2； P53； LIF； 反复自然流产； 子宫内膜； 蜕膜化

反复自然流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指与同一性伴侣连续发生3次或3次以上自然流产的现象[1],是一种常见的妊娠并发症。反复自然流产的病因非常复杂,包括胚胎染色体异常、免疫功能异常、内分泌异常,以及感染、子宫解剖异常和血栓前状态等。然而,临床上仍有超过55% RSA患者不能明确病因[2]。有研究表明,RSA患者子宫内膜具有“超容受性”,其子宫内膜基质细胞蜕膜化过程紊乱,致使子宫内膜种植窗期延长并且对胚胎的选择能力受损[3],从而可能发生非优质胚胎植入影响妊娠结局。

组蛋白甲基转移酶(SET and MYND domain containing protein 2,SMYD2)是SMYD家族的一个成员,它既可以甲基化多种组蛋白也可以甲基化非组蛋白,从而发挥多种生物学功能包括染色质重塑、转录、信号转导和细胞周期调控。SMYD2在正常、病变以及肿瘤组织中都有表达,与各个系统的发育、肿瘤的发生发展密切相关。目前,国内外尚未有关于SMYD2和反复自然流产关系的研究报道,本研究主要探讨SMYD2在RSA患者子宫内膜蜕膜化过程中的作用及其机制。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 兔抗SMYD2抗体、鼠抗P53抗体、兔抗P-P53抗体(Abcam公司),山羊抗兔荧光二抗488、抗鼠荧光二抗488、Trizol、反转录试剂盒(Invitrogen公司),FAST SYBR-Green(Applied biosystems公司),SMYD2特异性抑制剂AZ505(MedChem Express公司),DMEM/HIGH GLUCOSE培养基、胰蛋白酶 (HyClone公司),胎牛血清(FBS)、1×HBSS缓冲液(Gibco公司),胶原酶Ⅰ(Roche公司),青链霉素(P/G)(Thermo fisher公司),17β-雌二醇(E2)、孕酮(P4)、环磷腺苷(cAMP)(Sigma公司)。

1.1.2 实验材料 所有人子宫内膜标本在湖北医药学院附属十堰市人民医院生殖医学中心通过宫腔镜获得,对照组选择由于输卵管因素导致不孕的正常人,实验组选择反复自然流产3次的患者。所有研究对象月经周期正常,无内分泌、免疫和代谢疾病,没有激素相关疾病并且收集标本前3个月未接受过激素治疗。患者知情同意,研究符合伦理学并经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 实验细胞 为探究SMYD2在子宫内膜蜕膜化过程中的作用,以及其是否依赖于与P53形成信号通路而发挥作用,采用real-time PCR和免疫细胞化学法检测SMYD2、TRP53 mRNA和蛋白在正常人和RSA患者子宫内膜基质细胞和蜕膜化细胞中的表达规律和变化。正常人和RSA患者细胞均设有空白组、蜕膜化组、蜕膜化+抑制剂组,通过检测蜕膜化标志分子催乳素(prolactin,PRL)在正常人和RSA患者子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中mRNA的表达情况验证本实验蜕膜化处理是否成功。通过检测蜕膜化标志分子PRL mRNA和子宫内膜容受性标志分子LIF mRNA的表达情况验证SMYD2特异性抑制剂AZ505对蜕膜化的影响。

分组及处理:① 空白组(control):6孔板中加入2 ml/孔2%FBS/DMEM培养基,24孔板中加入1 ml/孔2% FBS/DMEM培养基。②蜕膜化组(E+P+C):6孔板中加入2 ml/孔含10 nmol/L E2、1 μmol/L P4和0.5 mmol/L cAMP的2% FBS/DMEM,24孔板中加入1 ml/孔以上培养基。③蜕膜化+抑制剂组(EPC+AZ505):即为在蜕膜化的基础上加入1 μmol/L SMYD2特异性抑制剂AZ505。

1.2.2 子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cell,ESC)原代培养 将子宫内膜组织分离成小段,用含P/G的1×HBSS 清洗3次,转入盛有胶原酶Ⅰ溶液的离心管中,37 ℃水浴摇床中消化1 h,用10%FBS/HBSS终止消化,吹打使细胞分散成单个,然后用200、400目筛网过滤,按5×105/ml密度接种细胞,用含P/G的10% FBS/DMEM培养,培养到第6代开始相关检测和药物处理。

1.2.3 子宫内膜基质细胞蜕膜化处理 细胞培养至第5代后以3×105/ml、1.5×105/ml密度接种于6孔板和放有爬片的24孔板,为第6代细胞,待细胞长至80%-90%时用雌、孕激素和环磷腺苷联合诱导内膜基质细胞蜕膜化,即用含10 nmol/L E2、1 μmol/L P4和0.5 mmol/L cAMP的2% FBS/DMEM培养细胞;蜕膜化+抑制剂组即为在以上蜕膜化的基础上加入 SMYD2特异性抑制剂AZ505,其工作浓度为1 μmol/L。记录加入培养基的时间,记为0 h,每48 h更换一次培养基。空白组和蜕膜化组细胞在0,48,96,144 h用Trizol 1 ml/孔收取6孔板细胞待提取RNA进行相关基因表达检测,蜕膜化+抑制剂组只收取144 h细胞。24孔板细胞爬片在144 h用于相关蛋白表达检测。

1.2.4 免疫细胞化学法 24孔板细胞爬片设空白组、蜕膜化组、蜕膜化+抑制剂组各3个孔,细胞处理后培养至144 h时进行实验。用1×PBS 1 ml/孔洗3次,5 min/次。4%多聚甲醛溶液1 ml/孔固定20 min,1×PBS洗3次,5 min/次。0.2% Triton X-100溶液700 μl/孔室温20 min,1×PBS洗3次,5 min/次。1% BSA溶液500 μl/孔封闭,37 ℃ 孵育1 h。一抗孵育:以SMYD2抗体为例,取干净载玻片,在载玻片上贴封口膜并滴加3滴1 ∶250兔抗SMYD2抗体,将空白组、蜕膜化组、蜕膜化+抑制剂组爬片细胞面分别扣盖在一抗液滴上,4 ℃过夜。以上述方法加1 ∶200兔抗P-P53抗体、1 ∶50鼠抗P53抗体。将爬片放入新的24孔板中,1×PBS洗3次,5 min/次。二抗孵育:在载玻片上贴封口膜并滴加与兔抗SMYD2抗体、兔抗P-P53抗体对应的山羊抗兔荧光二抗488稀释液(1 ∶400),与鼠抗P53抗体对应的山羊抗鼠荧光二抗488稀释液(1 ∶400),将对应的爬片细胞面扣盖在二抗液滴上室温孵育1 h。1×PBS洗3次,5 min/次。在新载玻片上滴加5 μl含有DAPI的荧光介质,将爬片细胞面扣盖在液滴上进行封片,荧光显微镜观察并照相。

1.2.5 real-time PCR 提取子宫内膜基质细胞和蜕膜化细胞RNA,反转录产生cDNA,然后用FAST SYBR-Green进行PCR反应。由于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在组织中的表达相对恒定,故用GAPDH作为内参进行校准。PCR反应条件为95 ℃变性20 s;95 ℃退火1 s;60 ℃延伸20 s,扩增40个循环。用标准曲线法对real-time PCR结果进行绝对定量统计。所用引物序列见表1。

表1 引物序列表

Table 1 Primer sequences

引物名称引物序列 SMYD2上游序列:CCTCGGAGACTGTAAGACTAA下游序列:GCTTGATTTCCTGTACAGCTC P53上游序列:TCCTCAGCATCTTATCCGAG下游序列:AGTGGTTTCTTCTTTGGCTG GAPDH上游序列:GAGATCCCTCCAAAATCAAG下游序列:CTGATGATCTTGAGGCTGTT PRL上游序列:CCTGTCCCACTACATCCATA下游序列:CTCTAGAAGCCGTTTGGTTT LIF上游序列:CAGCCCATAATGAAGGTCTT下游序列:CAACTGGCACAGCTCAAT

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 SMYD2、TRP53 mRNA和蛋白在子宫内膜蜕膜化细胞中的表达

通过检测蜕膜化标志分子PRL在正常人和RSA患者ESC蜕膜化48,96,144 h 时mRNA的表达情况,可见它在蜕膜化组均比空白组表达明显增高(P<0.05,见图1A、1D),说明本实验蜕膜化处理是成功的。

real-time PCR结果可见,在正常人48,96,144 h蜕膜化组SMYD2、TRP53 mRNA均比空白组表达降低(P<0.05,见图1B、1C)。在RSA患者,SMYD2 mRNA在蜕膜化48,96,144 h时比空白组表达降低(P<0.05,见图1E),TRP53 mRNA在蜕膜化48,144 h时比空白组表达降低(P<0.05),但在96 h时蜕膜化组与空白组差异无统计学意义(见图1F)。SMYD2和TRP53 mRNA在正常人和RSA患者蜕膜化细胞中表达趋势基本一致。

A-C.正常人PRL mRNA,SMYD2 mRNA,TRP53 mRNA表达;D-F.反复自然流产患者PRL mRNA,SMYD2 mRNA,TRP53 mRNA表达;con：空白组; E+P+C：蜕膜化组(E：雌二醇,P：孕酮,C：环磷腺苷cAMP);与空白组(con)比较,*P<0.05图1 子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中PRL、SMYD2和TRP53 mRNA表达Figure 1 The expression of PRL,SMYD2 and TRP53 mRNA in the process of decidualization of ESC

免疫细胞化学结果显示,在子宫内膜基质细胞和蜕膜化细胞中均检测到较强信号的P53、P-P53、SMYD2。P53蛋白表达在细胞质中,P-P53蛋白表达在细胞核,且只在细胞核的特定位置表达,SMYD2蛋白在细胞质和细胞核中均有表达。雌、孕激素联合环磷腺苷诱导子宫内膜基质细胞发生蜕膜化后,细胞由长梭形变圆并出现多核细胞。在正常人子宫内膜蜕膜化细胞中,P53蛋白信号较空白组稍微减弱(见图2A),P-P53和SMYD2蛋白信号较空白组明显减弱(见图2B,2C);RSA患者P53蛋白信号较空白组稍微减弱(见图2D),P-P53和SMYD2蛋白信号较空白组明显减弱(见图2E,2F)。P53、P-P53和SMYD2蛋白变化趋势在正常人和RSA患者子宫内膜蜕膜化细胞中基本一致。

A1,B1,C1.正常人空白组细胞；A2,B2,C2.正常人蜕膜化组细胞；A3,C2,C3.正常人蜕膜化+抑制剂组细胞；D1,E1,F1.RSA患者空白组细胞；D2,E2,F2.RSA患者蜕膜化组细胞；D3,E3,F3.RSA患者蜕膜化+抑制剂组细胞(蓝色：DAPI所染细胞核，绿色：蛋白质免疫荧光信号);P53蛋白表达在正常人和RSA患者基质细胞胞质中，P-P53蛋白表达在正常人和RSA患者基质细胞胞核中，SMYD2蛋白表达在正常人和RSA患者基质细胞胞质和胞核中；con：空白组 E+P+C：蜕膜化组 EPC + AZ505：蜕膜化+抑制剂组图2 P53、P-P53和SMYD2蛋白在正常人和RSA患者各组细胞中的表达 (×200)Figure 2 The expression of SMYD2,P53 and P-P53 protein in decidualized cells of normal controls and RSA patients by immunofluorescence assay (×200)

2.2 SMYD2特异性抑制剂AZ505对子宫内膜蜕膜化细胞中SMYD2、TRP53 mRNA和蛋白表达的影响

为进一步研究SMYD2在子宫内膜蜕膜化中的作用,本实验在对ESC蜕膜化处理的同时加入SMYD2特异性抑制剂AZ505 1 μmol/L。为验证抑制剂AZ505对蜕膜化的影响,本研究检测了蜕膜化标志分子PRL mRNA和子宫内膜容受性标志分子LIF mRNA的表达情况。用AZ505和EPC同时处理(AZ505+EPC)后,正常人和RSA患者细胞中PRL mRNA的表达均较蜕膜化细胞(EPC处理)中降低(P<0.05，见图3A);正常人和RSA患者LIF mRNA的表达较蜕膜化细胞中增高(P<0.05，见图3B)。

real-time PCR结果显示,正常人和RSA患者细胞用抑制剂AZ505和EPC处理后,SMYD2 mRNA的表达较蜕膜化细胞无明显差异(见图3C);而TRP53 mRNA的表达较蜕膜化细胞降低(P<0.05，见图3D)。

细胞免疫化学结果显示,用抑制剂AZ505和EPC同时处理细胞后,细胞形态较蜕膜化细胞并无明显改变。在正常人和RSA患者子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中加入抑制剂AZ505后,P53蛋白、P-P53蛋白和SMYD2蛋白信号较蜕膜化组减弱,尤其是SMYD2蛋白,在正常人细胞核中几乎看不到荧光信号,在RSA患者细胞核中只有微弱表达(见图2)。

con：空白组; E+P+C：蜕膜化组; EPC + AZ505：蜕膜化+抑制剂组(E：雌二醇; P：孕酮;C：环磷腺苷cAMP;AZ505：SMYD2特异性抑制剂)；与空白组(con)比较，*P<0.05;与E+P+C组比较，#P<0.05图3 SMYD2特异性抑制剂AZ505对子宫内膜基质细胞蜕膜化中PRL、LIF、SMYD2和TRP53 mRNA表达的影响Figure 3 Effect of inhibitor AZ505 on the expression of LIF,SMYD2 and TRP53 mRNA in the decidualization of endometrial stromal cells

3 讨论

反复自然流产是一种常见的妊娠并发症,虽然定义为与同一性伴侣连续发生3次或3次以上自然流产的现象,但近年多数专家认为连续发生2次流产的患者再次发生流产的机率与3次者相近。由于RSA病因非常复杂,且仍有超过55%患者病因不明,这使得临床治疗非常艰难。有研究表明,RSA患者与正常人相比子宫内膜具有“超容受性”[3],子宫内膜种植窗期延长,致使非优质胚胎植入从而发生流产。

子宫内膜蜕膜化对胚胎着床和妊娠维持至关重要,蜕膜化的破坏不仅可以导致着床失败和早期流产,而且在整个妊娠期都可能会引起不利结局[4]。研究表明,小鼠子宫缺失P53基因会使蜕膜细胞脂质稳态被破坏,从而致使蜕膜细胞过早衰老并引起自发早产[5]。

目前,关于SMYD2的研究主要集中在肿瘤和各系统的发育等方面。在赖氨酸残基370甲基化p53会抑制其活性,SMYD2通过抑制p53的肿瘤抑制作用而被认为具有癌基因的功能,它是癌症预后不良的一个重要因素[6,7]。研究表明,P53通路中的单核苷酸多态性(SNP)与不孕有关。体外受精(invitrofertilization,IVF)的不孕患者中,在第72位密码子编码脯氨酸的p53等位基因(p53 P72)比编码精氨酸的p53等位基因(p53 R72)明显丰富,对于35岁以下的IVF患者,P72是着床失败的危险因子,携带有同型纯合子p53 P72基因的患者妊娠率比至少携带一个p53 R72等位基因的患者明显降低[8]。此外,在利用辅助生殖技术助孕且有反复种植失败和反复流产病史的不孕患者中普遍存在p53 P72基因[9]。LIF是胚胎植入的关键因子,与子宫内膜容受性密切相关。胚胎着床时子宫内LIF瞬时表达升高,敲除LIF的小鼠会致使胚胎着床失败[10]。P53通过调节子宫内LIF的表达而与哺乳动物生殖密切相关,有研究表明,p53-/-的小鼠由于LIF水平下降而使胚胎不能着床,注射外源性LIF后胚胎可以着床[11]。

本研究发现,SMYD2和TRP53 mRNA在子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中表达下降。此外,在体外诱导子宫内膜基质细胞蜕膜化的同时应用SMYD2特异性抑制AZ505来进一步了解SMYD2在蜕膜化过程中的作用,实验结果显示,应用抑制剂后,蜕膜化标志分子PRL mRNA表达降低,这说明SMYD2可以影响子宫内膜基质细胞发生蜕膜化。然而,抑制剂AZ505并不影响SMYD2 mRNA的表达,细胞化学免疫荧光结果可见,应用AZ505后SMYD2蛋白信号减弱,尤其是细胞核中的信号减弱更明显,这说明AZ505并不影响SMYD2的转录水平,而是通过抑制其蛋白的表达而发挥生物学功能。此外,应用AZ505后LIF mRNA表达升高,TRP53 mRNA和蛋白表达下降,说明在蜕膜化过程中SMYD2对LIF和P53有调节作用,它可能是通过这种调节而在蜕膜化中发挥作用。

我们通过检测SMYD2和P53在子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中的表达以及应用特异性抑制剂AZ505后SMYD2、TRP53 mRNA和蛋白以及LIF mRNA的改变,推测SMYD2在反复自然流产患者子宫内膜蜕膜化过程中具有重要作用,而且是通过调节P53和LIF的表达而发挥作用,但其具体作用机制并不清楚,对其信号通路的进一步研究将为反复自然流产患者不良妊娠结局的原因提供新的思路,为临床改善妊娠结局提供新的治疗靶点。

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Role of SMYD2 in endometrial decidualization of recurrent spontaneous abortion patients and its mechanism

YANG Hui1,2，ZHANG Changjun1,2，DIAO Honglu2

(1DepartmentofGynaecologyandObstetrics,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China；2ReproductiveMedicineCenter,RenminHospitalofHubeiUniversityofMedicine;*Correspondingauthor,E-mail:542690700@qq.com)

ObjectiveTo investigate the expression of SMYD2 in stromal cells and decidual cells of patients with recurrent spontaneous abortion(RSA),and its regulation effect on P53 and LIF expression.MethodsThe endometrial stromal cells of normal and RSA patients was decidualizedinvitro,and the cells were divided into blank control group,decidualization group and decidualization+inhibitor group.Real-time PCR and immunocytochemistry were used to observe the mRNA and protein expression of LIF,SMYD2,P53 in endometrial decidual cells and the effect of SMYD2-specific inhibitor AZ505 on the expression of SMYD2,P53 and LIF.ResultsIn normal and RSA patients,the expression of SMYD2 and TRP53 mRNA in decidualization group was lower than that in blank control group(P<0.05).The level of LIF mRNA was significantly higher in normal controls and RSA patients in decidualization+inhibitor group than that in decidualization group,and the TRP53 mRNA level was lower(P<0.05),however,the level of SMYD2 mRNA showed no statistical difference between two groups.Immunocytochemistry results showed that the SMYD2,P53 and P-P53 protein signals were weaker in decidual cells of normal controls and RSA patients in decidualization group than in blank control group,and the expression of SMYD2,P53 and P-P53 protein in normal and RSA patients was weaker in decidualization+inhibitor group than that in decidualization group.ConclusionSMYD2 may be involved in the process of decidualization of RSA patients by regulating the expression of P53 and LIF.

SMYD2； P53； LIF； recurrent spontaneous abortion； endometrium； decidualization

湖北省自然科学基金资助项目(2015CFB543);湖北医药学院创新团队基金资助项目(2014CXX03,FDFR201604);湖北省重点学科建设和默克CREATE创新基金资助项目

杨慧,女,1988-12生,硕士,E-mail:1184404059@qq.com

2016-12-20

R711.71

A

1007-6611(2017)04-0337-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.008