小电导钙激活钾通道SK2在容量超负荷心力衰竭大鼠窦房结表达的改变

倪雅娟,张京文,白鸿远,杨国栋,马爱群*

(1西安交通大学第二附属医院心血管内科,西安 710004;2西安交通大学第一附属医院心血管内科;*通讯作者,E-mail:yuxi1128-@163.com)

小电导钙激活钾通道SK2在容量超负荷心力衰竭大鼠窦房结表达的改变

倪雅娟1,张京文2,白鸿远1,杨国栋2,马爱群2*

(1西安交通大学第二附属医院心血管内科,西安 710004;2西安交通大学第一附属医院心血管内科;*通讯作者,E-mail:yuxi1128-@163.com)

目的 观察小电导钙激活钾通道SK2通道在心力衰竭(HF)大鼠窦房结组织中表达的改变。 方法 以腹主动脉-下腔静脉穿刺造瘘术建立容量超负荷心力衰竭大鼠模型(n=7),假手术对照组(SO)大鼠切开腹腔,穿刺腹主动脉,但不造成腹主动脉-下腔静脉之间的瘘(n=7)。于术后8周通过超声心动图测定左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)、左心室收缩末内径(left ventricular end-systolic diameter,LVEDs)、左心室舒张末内径(left ventrieular end-diastolic diameter,LVEDd),并于取材时测定心脏质量/体质量(heart weight/body weight)，评价心脏结构与功能改变。分离大鼠窦房结细胞以免疫荧光染色法观察SK2通道蛋白的表达,同时取材窦房结组织,提取组织蛋白,行Western blot测定比较心衰大鼠窦房结组织SK2通道表达的改变情况。 结果 超声心动图结果显示,心力衰竭大鼠心脏收缩功能与舒张功能明显减低[LVEDd(mm):SO 5.91±0.36vsHF 11.15±0.91,P<0.01;LVEDs(mm):SO 2.89±0.28vsHF 7.89±0.70,P<0.01;LVEF(%):SO 87.10±1.63vsHF 62.10±2.57,P<0.01;LVFS(%):SO 51.27±2.03vsHF 30.05±1.66,P<0.01],心脏质量/体质量明显增大(SO 244.19±36.87vsHF 593.21±28.72,P<0.01)。单细胞免疫荧光染色结果示SK2通道表达于两组大鼠窦房结细胞膜上,Western blot定量分析结果示心力衰竭组大鼠窦房结组织SK2通道蛋白表达水平较假手术组明显减低(0.22±0.10vs0.31±0.16,P<0.05)。 结论 SK2通道在心力衰竭大鼠窦房结组织中表达明显下调。

小电导钙激活钾通道; SK2通道; 心力衰竭; 窦房结; 大鼠

窦房结是哺乳类心脏的正常节律性冲动的发源地,窦房结细胞通过自发性舒张期除极化,引起其自主性起搏。一般认为窦房结的起搏和传导功能是在多种离子电流的共同参与下形成,如延迟整流钾电流、背景钠电流、超极化激活内向电流等[1]。心力衰竭时窦房结发生重构,主要为功能重构[2],其本质为窦房结离子通道重构,致窦房结动作电位(APD)延长[3,4],研究发现,窦房结功能不全主要是因为窦房结离子通道重构致,包括钾通道、钙通道、钠通道、超极化激活阳离子通道等通道重构,但具体机制仍不十分清楚。

小电导钙激活钾通道(small conductance calcium activated potassium channel,SK)于1986年被发现并正式命名,是一种电导较小(60 pF)的钾通道,依赖于细胞内钙离子激活[5]。SK通道主要有3种亚型：SK1、SK2、SK3[6],研究显示,SK2通道介导复极化电流,在心肌细胞、房室结复极化中起重要作用[7-9]。最近的研究发现SK2通道在窦房结细胞动作电位的复极化过程中也起重要作用,若将其阻断,窦房结细胞动作电位时程延长,起搏频率减低[10],因此SK2通道在窦房结APD中起重要作用。然而,通道表达是其功能的基础,心力衰竭过程中SK2通道的表达是否重构,窦房结中的表达情况仍无研究。本研究通过建立容量超负荷大鼠心衰模型,观察心力衰竭窦房结组织的小电导钙激活钾通道表达的变化,以探讨心力衰竭窦房结重构的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠,遗传基本组成为远交群大鼠,系杂合的雄性大鼠和Wistar雌性大鼠杂交后育成的一个白化封闭群大鼠,5周龄,体质量140-160 g,购于西安交通大学医学院实验动物中心,生产许可证号:SCXK(陕)2012-003。

1.2 主要试剂与仪器

SK2兔抗大鼠多克隆抗体(以色列Alomone Labs公司),兔抗大鼠GAPDH抗体(美国Santa Cruz公司)、羊抗兔IgG-FITC(武汉博士德生物工程有限公司),蛋白Marker(加拿大Fermentas公司),Ⅱ型胶原酶(美国Worthingtong公司),蛋白酶、牛血清白蛋白(美国Sigma公司),SZ-61型解剖显微镜、BX51型荧光生物显微镜(Olympus公司),TCS-SP2激光共聚焦显微镜(德国Leica公司),THONOS 2500心脏彩色超声诊断仪(美国惠普公司),激光共聚焦显微镜(德国Leica公司),微型凝胶电泳系统、ChemiDoc XRS化学发光荧光成像仪(美国Bio-Rad公司),ECL发光液(美国Pierce公司),BCA蛋白定量试剂盒、单去污裂解液(美国Bio tech公司),蛋白酶抑制剂混合物(cocktail,美国Roche公司)。

1.3 主要溶液配制

①台式液:NaCl 140 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、MgCl2 1.0 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L、Glucose 10.0 mmol/L(NaOH调节pH值为7.35-7.45);②无钙台式液:NaCl 140 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、MgCl21.0 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L、Glucose 10.0 mmol/L(NaOH调节pH值为7.35-7.45);③窦房结细胞消化酶液:30 ml无钙台式液中加入Ⅱ型胶原酶220 IU/ml,蛋白酶0.03%,BSA 30 mg(0.1%),CaCl20.06 mmol/L(NaOH调节pH值为6.8);④心肌细胞储存液(Kraftbrabe,KB):KCl 25 mmol/L,KH2PO410.0 mmol/L, MgCl23.0 mmol/L,牛磺酸 20.0 mmol/L,L-谷氨酸80.0 mmol/L,EGTA 0.5 mmol/L, HEPES 10.0 mmol/L, Glucose 10.0 mmol/L,KOH调节pH值为7.35-7.45。免疫荧光、Western blot所需液体配制方法同本课题组既往报道[11]。

1.4 容量超负荷心力衰竭大鼠模型的建立及评价

SD大鼠随机分为心衰组(heart failure,HF;n=14)和假手术组(sham operation,SO;n=14),心衰组采用腹主动脉一下腔静脉穿刺造瘘术建立容量超负荷心衰模型[12],简而言之,大鼠麻醉后腹部正中切口4 cm,充分暴露腹主动脉和下腔静脉,自左侧肾动脉下方,钝性分离出腹主动脉和下腔静脉,显微持针器持9/0带线缝合针,在左右髂总动脉分支上方3 mm处腹主动脉前壁做U形缝合,并在左侧肾动脉下方夹闭腹主动脉血流,持留置针头(内充低分子肝素钠抗凝)从U形缝合口进针穿入腹主动脉,针头沿前壁向上行至腹主动脉和下腔静脉的联合部,向右穿破此处的相邻动静脉壁,行至下腔静脉,造成动-静脉瘘。退出针头并迅速收紧缝合口,此时静脉膨胀,颜色变红并有搏动,穿刺部位可见明显涡流。假手术组只穿刺进入腹主动脉,不进入下腔静脉造瘘,其余手术步骤与动-静脉瘘组相同。假手术组只切开腹腔,穿刺腹主动脉,不穿刺下腔静脉,即不造成腹主动脉-下腔静脉之间的瘘,余步骤同心衰组。术后8周行心脏超声检查,评价两组大鼠心功能。

1.5 单个窦房结细胞的分离及鉴定

实验大鼠取心脏,解剖显微镜下取窦房结组织,左右界限为界嵴和房间隔,上下边界为上、下腔静脉,窦房结的长轴几乎于界沟的走向一致[13]。分离窦房结细胞的方法在小鼠窦房结细胞分离方法上有所改进[14]。将窦房结组织剪成1 mm的小条置入消化酶液中,37 ℃恒温消化过程持续15-19 min,肉眼观察组织条粉红透亮、膨胀松软、呈现云絮状,以KB液终止消化,轻柔牵拉组织条,KB液变浑浊,窦房结细胞即释放至KB液中。220 μm尼龙网过滤以除去组织块,室温静置30 min,逐渐复钙至1.0 mmol/L。分离细胞的鉴定:①形态学观察:光学显微镜下观察细胞形态,窦房结细胞呈不规则形态,有梭形、弯曲、弧形等;②HCN4免疫荧光染色:HCN4为特异性表达于窦房结组织的超极化阳离子通道,通常以其的阳性表达来鉴定窦房结细胞[15]。

1.6 定性观察SK2通道在窦房结组织表达

分离两组大鼠单个窦房结细胞,行单细胞免疫荧光染色,步骤如文献[16]所述,以激光共聚焦显微镜观察SK2通道在窦房结细胞的表达情况。

1.7 定量检测心力衰竭窦房结组织SK2通道表达的改变

Western blot定量观察两组大鼠窦房结组织SK2通道蛋白的表达水平。窦房结组织取材后,提取组织蛋白的方法如文献[17]所述,95 ℃煮沸5 min使蛋白变性,BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,冰浴100 V恒压转膜90 min,将蛋白转移至PVDF膜。PVDF膜在含5%脱脂奶粉的TBST中4 ℃过夜封闭,漂洗后予一抗室温下孵育2 h,洗涤后予二抗(羊抗兔IgG HRP抗体)室温下孵育1 h,ECL试剂盒使条带显色,ChemiDoc XRS化学发光荧光成像仪采集图像,Quality One软件分析结果,以目的条带累计光密度值/内参GAPDH累计光密度值,获得结果。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 心力衰竭大鼠模型的成功建立

腹主动脉-下腔静脉造瘘术后8周,行超声心动图检查，结果显示,心衰组大鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)与左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)较假手术组明显降低(均P<0.01，见表1),心衰组大鼠左心室收缩末内径(left ventricular end-systolic diameter,LVEDs)、左心室舒张末内径(left ventrieular edn-diastolic diameter,LVEDd)较假手术对照组大鼠明显增加(均P<0.01，见表1)。结果证明与假手术组相比,心衰组大鼠左心室收缩与舒张功能明显下降,左心室心腔明显扩张,表明容量超负荷心衰模型成功建立。

表 1 HF组大鼠和SO组大鼠超声心动学指标比较 (n=7)

Table 1 Comparison of echocardiographical results between HF and SO rats (n=7)

组别LVEDd(mm)LVEDs(mm)LVEF(%)LVFS(%)SO组591±036289±0288710±1635127±203HF组1115±091∗∗789±070∗∗6210±257∗∗3005±166∗∗

LVEDd:左室舒张末内径;LVEDs:左室收缩膜内径;LVEF:左室射血分数;LVFS:短轴缩短率;与SO组比较,**P<0.01

2.2 两组大鼠心脏质量/体质量结果

称量大鼠体质量、心脏重量,计算两组大鼠心脏质量/体质量,并行统计学分析,结果显示,心衰组大鼠心脏质量及心脏质量/体质量比均较假手术组显著增加(P<0.01，见表2),证明在慢性心衰过程中发左心室重构,心腔扩大,心脏结构改变,心脏增大。

表 2 两组大鼠组大鼠体质量、心脏质量、心脏质量/体质量的比较

Table 2 Comparison of BW,HW,HW/BW between HF and SO rats

组别 BW(g) HW(g)HW/BW(mg/100g)SO组(n=7)34152±3046081±01924419±3687HF组(n=7)37229±3451∗∗219±067∗∗59321±2872∗∗

BW:体质量;HW:心脏重量;HW/BW:心脏质量/体质量;与SO组比较，**P<0.01

2.3 窦房结细胞的鉴定

酶解分离的单个窦房结细胞行HCN4免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察结果可见,窦房结细胞形态不规则,有梭形、弧形、弯曲形等,细胞横纹清楚、细胞核可见。HCN4均匀地表达于窦房结细胞的细胞上,因HCN4在窦房结表达具有特异性,进一步证实分离所得的细胞为窦房结细胞,结果见图1。

图1 HCN4在SO组与HF组大鼠的分离细胞呈阳性表达Figure 1 The positive expression of HCN4 in isolated cells of SO and HF rats

2.4 SK2通道在SO组及HF组大鼠窦房结细胞表达的定性观察

以上述方法分离的单个窦房结细胞,行SK2通道免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察结果可见,SK2通道表达于SO组及HF组大鼠窦房结细胞膜上,细胞核、细胞浆区表达呈阴性(见图2);肉眼可见HF组窦房结细胞的荧光强度较假手术对照组低。

2.5 SO组及HF组大鼠SK2通道表达的定量分析

Western blot定量结果表明SK2通道在两组大鼠窦房结均有表达,HF组大鼠窦房结SK2通道表达水平明显低于SO组大鼠(SO 0.31±0.16,HF 0.22±0.10,P<0.05,见图3),证明SK2通道在心力衰竭组大鼠窦房结组织发生重构,表达明显下调。

3 讨论

窦房结功能的基础是窦房结细胞膜上离子电流的共同作用,形成动作电位。研究显示SK2通道参与窦房结细胞复极化过程,在窦房结功能中起重要作用[10],而SK2通道在窦房结组织的表达如何尚无研究。本研究通过分离单个窦房结细胞行免疫荧光染色,结果证实SK2通道表达于大鼠的窦房结细胞膜上,在细胞核、细胞浆均无表达,提示窦房结细胞SK2的表达是SK2通道作用于窦房结复极化的分子基础。

A,B,C,D.SO组大鼠窦房结细胞SK2通道的表达;E.SO组阴性对照细胞;F,G,H,I.HF组大鼠窦房结细胞SK2通道的表达;J.HF组阴性对照细胞图2 SO组与HF组大鼠窦房结细胞SK2通道的免疫荧光染色Figure 2 The immunofluorescence staining results of SK2 in sinoatrial node cells of SO and HF rats

图3 SO组及HF组大鼠窦房结组织SK2通道蛋白Western blot结果Figure 3 Western blot analysis of SK2 protein in the sinoatrial node tissue of HF and SO rats

心力衰竭是多种心血管疾病的最终归宿,其患病率高,预后差。心力衰竭患者易并发窦房结功能不全,表现为固有心率显著减慢,固有窦性周期长度、校正后窦房结恢复时间及窦房传导时间明显延长。研究表明,心力衰竭窦房结功能不全的本质为窦房结细胞膜上的离子通道表达和功能异常,离子电流重构,导致窦房结APD延长。大量研究显示心力衰竭时窦房结细胞If、IKs明显下调,钾通道(ERG、KvLQT1、Kir2.4、TASK1、TWIK1、TWIK2)、钙通道、钠-氢交换体等离子通道的表达显著上调,致窦房结固有心率下降,校正后窦房结恢复时间延长[3,4],本实验室前期研究证实,心力衰竭时窦房结组织神经型钠通道Nav1.1,Nav1.6表达明显下调,可能参与心力衰竭窦房结功能不全的形成[11]。

综上所述,SK2通道介导复极化电流,参与心房肌、房室结、窦房结等细胞复极化过程,其通道蛋白表达于窦房结细胞膜上,在窦房结细胞APD中起重要作用,药物阻断后窦房结细胞APD延长,窦房结组织起搏频率明显减慢。心力衰竭窦房结功能不全的本质为窦房结细胞膜上离子通道的重构致APD延长,而SK2通道在窦房结APD中的作用重大,为探讨SK2通道在心力衰竭窦房结中的表达情况,本研究通过建立容量超负荷大鼠心力衰竭模型,采用分离窦房结细胞行免疫荧光染色及免疫印迹等方法证实,SK2通道在心力衰竭窦房结组织中发生重构,通道蛋白表达明显下调,可能致窦房结细胞APD延长及窦房结起搏频率减慢,进而参与心力衰竭窦房结功能不全的形成。阐明SK2通道在心力衰竭窦房结中表达的重构情况对进一步认识心力衰竭窦房结功能不全的发生机制具有重要意义,为心力衰竭窦房结功能不全的靶向治疗手段的研发提供重要的理论依据。

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Changes of small conductance calcium-activated potassium channel SK2 expression in sinoatrial node of heart failure rats induced by volume-overload

NI Yajuan1,ZHANG Jingwen2,BAI Hongyuan1,YANG Guodong2,MA Aiqun2*(1

DepartmentofCardiology,SecondAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,Xi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:yuxi1128-@163.com)

ObjectiveTo investigate the changes of SK2 channel expression in sinoatrial node of the heart failure(HF) rats induced by volume-overload.MethodsThe volume-overload HF rats were induced by aortocaval fistula(ACF,n=7),and the sham-operated rats were regarded as control group(SO,n=7). The abdominal cavity was opened to puncture abdominal aorta without making a fistula between abdominal aorta and inferior vena cava in SO rats. The echocardiogram indexes such as left ventricular end-systolic diameter(LVEDs),left ventricular end-diastolic diameter(LVEDd),left ventricular fraction shortening(LVFS),left ventricular end-systolic diameter(LVEDs) were measured at week 8 after operation, and the ratio of heart weight(HW) to body weight(BW) was caculated. Then the sinoatrial node cells were isolated and collected to observe the expression of the SK2 channel protein by immunofluorescent staining. Meanwhile, sinoatrial node tissues of rats were isolated to determine the change of SK2 channel protein expression by Western blot.ResultsThe data of echocardiogram showed that the systolic and diastolic function in HF rats significantly declined [LVEDd(mm):SO 5.91±0.36vsHF 11.15±0.91,P<0.01;LVEDs(mm):SO 2.89±0.28vsHF 7.89±0.70,P<0.01;LVEF(%):SO 87.10±1.63vsHF 62.10±2.57,P<0.01;LVFS(%):SO 51.27±2.03vsHF 30.05±1.66,P<0.01)], and the ratio of HW to BW significantly increased (SO 244.19±36.87vsHF 593.21±28.72,P<0.01). The results of immunofluorescent staining indicated that the SK2 channels were located on membrane of single sinoatrial node cell. The Western blot results demonstrated that the protein expression of SK2 was down-regulated significantly in sinoatrial node of HF rats compared with SO rats(0.22±0.10vs0.31±0.16,P<0.01).ConclusionThe expression of SK2 channel protein is significantly down-regulated in sinoatrial node of HF rats.

small conductance calcium-activated potassium channel; SK2 channel; heart failure; sinoatrial node; rats

中央高校基本科研业务费专项基金资助项目(0817-1191320076)

倪雅娟,女,1986-11生,博士,住院医师,E-mail:finley007@163.com

2017-03-02

R541.6

A

1007-6611(2017)07-0641-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.001