BDNF对脓毒症相关性脑病大鼠学习记忆功能的改善作用

王雪飞，周坤鹏，岳 源，谢 敏，张金鑫，陈 群，鲁卫华

(1.皖南医学院 麻醉学院，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 重症医学科，安徽 芜湖 241001)

BDNF对脓毒症相关性脑病大鼠学习记忆功能的改善作用

王雪飞1，周坤鹏1，岳 源1，谢 敏1，张金鑫1，陈 群2，鲁卫华2

(1.皖南医学院 麻醉学院，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 重症医学科，安徽 芜湖 241001)

目的：探讨脑源性神经营养因子(BDNF)对脓毒症相关性脑病(SAE)大鼠的学习记忆功能的影响及其机制。方法：采用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症相关性脑病模型，取成年雄性SD大鼠40只随机分为4组，每组10只：假手术组(Sham组)、模型组(CLP组)、BDNF组(B组)、酪氨酸激酶B受体拮抗剂组(N组)。于造模前Sham组和CLP组侧脑室注射5 μL生理盐水，B组注射BDNF(2 ng/μL)5 μL，N组注射酪氨酸激酶B受体(TrkB)拮抗剂NTrk2(1 μg/μL)5 μL后再行盲肠结扎穿孔制作脓毒症大鼠模型，术后第2～6天行Morris水迷宫定位航行训练，术后第7天行空间探索实验。结果：与Sham组比较，CLP组、N组大鼠逃避潜伏期延长(P<0.05)，CLP组、B组、N组目标象限停留时间占全象限停留时间比以及探索次数明显减少(P<0.05)；与Sham组比较，CLP组、N组虚拟平台穿越次数减少(P<0.05)，与CLP组比较,B组平台穿越次数增多(P<0.05)；4组大鼠在游泳速度上差异无统计学意义。结论：脓毒症可致大鼠认知功能受损，BDNF可改善脓毒症相关性脑病大鼠的学习记忆功能，其机制可能与BDNF-TrKB信号通路有关。

脓毒症相关性脑病；脑源性神经营养因子；MORRIS水迷宫

脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)是指由感染引起的全身炎症反应综合征而导致的急性弥漫性脑功能障碍，其缺乏中枢神经系统感染的临床或实验室证据，患者通常伴有急性、可逆的精神状态改变，并以谵妄、认知和行为改变为常见表现[1]。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)广泛存在于大脑皮质、海马、下丘脑、脑干、基底前脑、纹状体和小脑等部位,可通过与酪氨酸激酶B受体(Tyrosine kinase receptor B，TrkB)与营养神经结合，有改善神经突触可塑性，促进神经元存活、分化以及增强功能表达，加快损伤神经元修复等作用[2]。本研究通过盲肠结扎穿孔法制作脓毒症大鼠模型，探讨BDNF在脓毒症认知功能障中的作用，并进一步探讨脓毒症脑功能障碍的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 成年雄性大鼠40只，体质量200～220 g(南京青龙山动物饲养场，许可证号：SCxk2014-0007)。采用随机数字法分为4组，每组10只：假手术组(Sham组)、模型组(CLP组)、BDNF组(B组)、TrkB拮抗剂组(N组)。

1.2 模型建立 采用盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture，CLP)建立脓毒症大鼠模型，实验前禁食12 h,不禁水。采用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪(型号：68001R，深圳瑞沃德生命科技有限公司)，外科消毒，矢状位作约1.5～2 cm皮肤切口，暴露前囟和颅骨缝，参照大鼠脑定位图谱微量注射器行侧脑室定位注射[3](前囟点后1.0 mm，矢状缝旁开1.5 mm,进针深度4 mm)，后用牙科胶封闭。假手术组和模型组均注射0.9%生理盐水，B组注射含2 ng/μL BDNF溶液5 μL(重组BDNF,武汉博世德生物公司,批号：BP4053)，N组注射TrkB受体拮抗剂NTrk2(1 μg/μL)5 μL(NTrkB，novoprotein公司，批号：C507)。侧脑室注射后制作脓毒症模型，腹中线做一1 cm长的切口，距盲肠末端1.2 cm处结扎后用22号针头贯穿末端盲肠两次，挤压出少许肠内容物还纳，依次缝合关腹腔，其中假手术组不行结扎穿孔操作，术后各组大鼠均予以皮下注射30 mL/kg生理盐水。

1.3 水迷宫实验 各组大鼠均于造模后24 h进行Morris水迷宫实验(Morris water maze，MWM，型号：XR-XM101,上海欣软信息科技有限公司)，分为定位航行和空间探索实验。①定位航行实验：共5 d，每天上午9点进行试验训练4次，随机选择4个象限的外缘圆弧中点入水，入水时将大鼠面向池壁轻柔放入水中，由计算机采集分析系统记录大鼠逃离潜伏期(即入水后寻找并爬上平台所需的时间)和游泳速度。每次实验的时间限制为120 s，在120 s内大鼠找到平台或超过120 s未找到平台，都将其放在平台上休息15 s，然后进行下一次实验；如在120 s内未找到平台，则逃避潜伏期记为120 s。②空间探索实验：在定位航行实验结束后24 h进行，撤去平台，选择平台对角的象限为入水点，记录大鼠在120 s内停留在各象限的时间百分比及通过虚拟平台的次数。

2 结果

2.1 4组大鼠死亡情况 本研究中，Sham组大鼠死亡1只(10%)，CLP组大鼠死亡5只(50%)，B组大鼠死亡5只(50%)，N组大鼠死亡4只(40%)，余25只完成全部实验。

2.2 4组水迷宫实验结果

2.2.1 水迷宫逃避潜伏期的比较 对各组大鼠水迷宫逃避潜伏期进行重复测量方差分析，逃避潜伏期在不同测试日上差异具有统计学意义，即随着训练时间的增加逃避潜伏期缩短(F=100.20，P<0.01)；逃避潜伏期与组别之间有交互作用(F=2.81，P<0.05)，不同处理组别的逃避潜伏期差异有统计学意义(F=7.07，P<0.05)，与Sham组相比，各测试日CLP组、N组逃避潜伏期延长(P<0.05)，B组差异无统计学意义。见表1。

2.2.2 水迷宫游泳速度的比较 对各组水迷宫游泳速度进行重复测量方差分析，游泳速度在不同测试日上差异具有统计学意义(F=20.37，P<0.01)，即脓毒症大鼠随着训练时间的增加游泳速度减慢；游泳速度与组别之间无交互作用(F=1.63，P>0.05)，各测试日4组大鼠之间在游泳速度上差异无统计学意义(F=2.48，P>0.05)。见表2。

2.2.3 空间探索实验的比较 空间探索实验中，与Sham组比较，CLP组、B组、N组目标象限停留时间占全象限停留时间比明显减少(P<0.05)；CLP组、B组、N组目标象限停留时间占全象限停留时间百分比差异无统计学意义；与Sham组比较，CLP组、N组虚拟平台穿越次数减少(P<0.05)，与CLP组比较,B组平台穿越次数增多(P<0.05)。见表3。

s

注：与sham组比较，aP<0.05。

cm/s

组别n穿越次数目标象限停留时间百分比/%Sham组95.90±1.8536.45±17.88CLP组53.40±1.52a23.89±18.83aB组55.80±0.84b28.43±13.92aN组62.50±1.05a25.92±11.86aF8.7519.375P0.0010.000

注：与sham组比较，aP<0.05；与CLP组比较，bP<0.05。

3 讨论

脓毒症相关性脑病表现为弥漫性大脑功能障碍，使脓毒症患者出现长期认知功能损害，超过70%以上脓毒症患者严重影响出院后生活,合并脓毒症相关性脑病的脓毒症患者的病死率高达49%，而无脑病的脓毒症患者病死率仅为26%[4-5]。本研究发现脓毒症组大鼠死亡数高，并且大鼠水迷宫实验逃避潜伏期延长以及目标象限停留时间百分比和平台探索次数减少，表明脓毒症可致大鼠认知学习能力受损。脓毒症引起的炎性反应导致大脑局部微环境紊乱、神经递质改变等可能与大鼠学习认知功能受损有关。Zhang等[6]研究发现SAE大鼠的神经元严重水肿，形态改变，细胞核不规则，核膜皱缩，胞质水肿，细胞器数量明显减少,脑组织TUNEL染色可见明显的神经元细胞凋亡。其相关机制为全身性炎症反应造成内皮细胞损伤，导致微循环堵塞和组织灌流障碍，同时活化的中性粒细胞聚集产生大量的溶酶体酶和氧自由基等介质，使血脑屏障损伤，而大量释放的炎性因子如IL-10、IL-6、TNF-α等，在不同脑区诱发氧化应激反应致细胞凋亡。另外脓毒症所致的认知功能改变与神经元突触可塑性及神经元细胞的某些基因的表观遗传学改变亦有密切关系[7]。

本研究结果显示，经BDNF处理的B组较CLP组目标象限停留时间占全象限停留时间比增加，同时平台穿越次数及潜伏期缩短，但对于游泳速度并无明显影响；尽管BDNF未能改善SAE大鼠的生存率，但BDNF可改善SAE大鼠的认知功能和空间学习能力。BDNF通过与TrkB结合使TrkB磷酸化，从而激活细胞内通路包括丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶、磷脂酶和磷脂酰肌醇3激酶信号通路，这些通路对于神经干细胞增殖分化、神经元损伤后修复以及减少神经细胞退行性变等方面发挥重要作用，影响着神经元的存活、突触形成和塑形。研究表明脊髓损伤时给予BDNF后能明显维持和延长脊髓损伤处的轴突，增强突触联系及突触间神经递质的释放，刺激神经元轴突树突的生长延长[8]；在单侧和双侧坐骨神经切断实验中发现BDNF表达的变化可促进作为神经再生标志的轴突膜蛋白43(growth associated protein-43,GAP-43)的表达。BDNF除了对神经元再生有促进作用外，在神经应激损伤的初期对神经元还有保护作用，近年的研究表明BDNF对应激条件下学习记忆及外显行为的改变产生重要影响[9-10]。在大脑皮层和海马，几乎所有的兴奋性突触都由树突棘构成，其形态和功能的可塑性是参与学习记忆的重要分子机制，BDNF与TrkB结合引起TrkB活化从而在空间学习和突触可塑性中发挥重要的作用[2]，因此BDNF基因表达减少、其相关信号传递BDNF-TrkB功能异常可能是认知功能改变的主要原因。

综上所述，本研究结果表明BDNF可改善SAE大鼠的学习记忆功能，其机制可能与激活BDNF-TrkB信号通路有关。

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Effects of BDNF on improving cognitive dysfunction in rats with sepsis-associatedencephalopathy

WANG Xuefei,ZHOU Kunpeng,YUE Yuan,XIE Min,ZHANG Jinxin,CHEN Qun,LU Weihua

School of Anesthesiology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To investigate the effects of brain derived neurotrophic factor(BDNF) on the learning and memory function in rats with sepsis and the potential mechanisms.Methods:Forty male SD rats with sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP) were randomized into sham operation group (sham group),SAE model group(CLP group),BDNF group(B group) and TrkB receptor antagonist group(N group).Before model establishment,rats in the sham group and CLP group were injected with saline via intracerebroventricle in dose of 5μL,and those in B group were administered with BDNF(2 ng/μL) in dose of 5μL.Rats in N group were treated with the same volume of TrkB receptor antagonist (NTrk2,1 μg/μL).Morris water maze test was performed to test the place navigation of rats from day 2 to 6,and space exploration test was performed by day7.Results:Compared to the sham group,rats in CLP and N groups had longer escape latency(P<0.05),and those in CLP,B and N groups had significantly reduced percentage of crossing target quadrant and exploring frequencies(P<0.05).Rats in CLP and N groups had reduced frequencies of platform crossing compared to those in sham group(P<0.05),whereas rats in B group had higher number of times of crossing platform than those in CLP group(P<0.05).The swimming velocity remained no statistical difference in four groups.Conclusion:Damaged cognitive function of rats with sepsis-associated encephalopathy can be reversed by BDNF.The potential mechanism may be involved in BDNF-TrkB signaling pathway.

sepsis-associated encephalopathy；brain derived neurotrophic factor；Morris water maze

1002-0217(2017)04-0311-04

安徽省大学生创新训练计划项目(AH201410368079);安徽省公益性技术应用研究联动计划项目(1604f0804043)

2016-11-30

王雪飞(1994-)，男，2012级麻醉专业本科生，(电话)18119883587，(电子信箱)550391638@qq.com； 鲁卫华，男，主任医师，副教授，(电子信箱)lwh683@126.com，通信作者。

R 749.1

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.04.002