印楝素在甘蓝及土壤中的消解动态

杨晓云， 黄其亮， 江腾辉， 徐汉虹

(1 天然农药与化学生物学教育部重点实验室/华南农业大学 农学院，广东 广州510642； 2 广东省环境保护职业技术学校，广东 广州 510655； 3广东省农业有害生物预警防控中心，广东 广州510500)

印楝素在甘蓝及土壤中的消解动态

杨晓云1， 黄其亮2， 江腾辉3， 徐汉虹1

(1 天然农药与化学生物学教育部重点实验室/华南农业大学 农学院，广东 广州510642； 2 广东省环境保护职业技术学校，广东 广州 510655； 3广东省农业有害生物预警防控中心，广东 广州510500)

【目的】甘蓝Brassicaoleracea生长期施用w为0.3%的印楝素乳油，检测印楝素在甘蓝和土壤中的残留及消解动态。【方法】印楝素在0.05～5.00 mg·kg-1水平范围内取0.1、0.5、1.0 mg·kg-1添加，样品中的印楝素经乙腈超声波辅助提取，弗罗里硅土固相萃取柱净化，高效液相色谱(HPLC) 检测，外标法定量。【结果】印楝素在甘蓝中的平均回收率为88.52%～93.21%，相对标准偏差为2.75%～3.55%；在土壤中平均回收率为90.69%～93.32%，相对标准偏差为2.09%～3.46%。印楝素在甘蓝中的残留半衰期为0.89 d，在土壤中的残留半衰期为2.40 d。【结论】印楝素属易降解农药。该施药方法安全可靠，值得借鉴。

印楝素； 乳油； 甘蓝； 土壤； 农药残留； 高效液相色谱

印楝素(Azadirachtin)是一类从印楝Azadirachtaindica中分离出来的活性较强的化合物，它属于四环三萜类，结构复杂，其活性最好的是印楝素A，目前发现的活性成分还有印楝素B等[1]。印楝素是世界公认的低毒、广谱、高效、易降解的杀虫剂[2-3]。到目前为止，我国尚未出台印楝素的最大允许残留值及相关检测方法，但根据欧盟地区的标准，蔬菜中印楝素的MRL为1.0 mg·kg-1。目前，分光光度法在测定印楝素总含量方面的应用较为普遍[4-5]，但其他物质容易对其产生干扰；对于较高含量的印楝素的测定，可用薄层色谱酸化香兰素显色法[6]；液相色谱法可用于分析植物生长与印楝素的相关性[7]和茶叶中印楝素的残留量[8]，也可分析水[9]、土壤[10]和橄榄树Canaviumalbum[11]中印楝素的降解。

对印楝素在草莓Fragariaananassa、番茄Solanumlycopersicum等水果上的残留已有研究报道[12-14]，而在蔬菜上的残留则鲜见报道。本研究根据文献[15]中的方法设计田间试验，印楝素乳油施用于甘蓝田后，采用超声波萃取、固相萃取净化、高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)测定甘蓝和土壤中印楝素的残留，记录印楝素在甘蓝及土壤中的消解动态，以期规避农药残留风险。

1 材料与方法

1.1 材料

Agilent1100高效液相色谱仪(配DAD 检测器、自动进样器、化学工作站)；旋转蒸发器EYELAN-1100(日本EYELA公司)；超声波清洗器KH-500(昆山创超声仪器有限公司)；循环水真空泵SHB-Ⅲ；组织捣碎机MJ-25BM02C(常州博远实验仪器厂)；烘箱S.C.101(上海试验仪器厂)；万分之一电子天平BS210S(德国Sa RtoRius公司)；精密移液枪(德国艾本德公司)。

SPE 小柱(Florisil，标准样品为1g)；w为95%印楝素标准品(美国Sigma公司)；甲醇和乙腈为色谱纯(美国MREDA公司)；w为0.3%印楝素乳油(成都绿金生物科技有限责任公司)；乙腈、丙酮、氯化钠、正己烷为分析纯(天津富宇精细化工有限公司)，自制超纯水，电阻≥18.0 MΩ。

1.2 方法

1.2.1 田间试验方案及样品采集 试验小区面积均为30 m2，另外设空白对照区，每组3 个重复，并在各小区间进行相应隔断处理。采用常规手动喷雾器对甘蓝进行喷雾处理，1次施药，多次取样。施药时间结合甘蓝的害虫防治期和推荐采收间隔期确定。施药剂量是5.4 g·m-2。土壤残留消解动态试验在旁边随机选择的空白地进行。于药后1、6 h和1、2、3、4、5、7 d采集样品。每次在每个小区内随机采集多于1 kg 生长正常的植株，在小区内随机采集深度为0～10 cm处的土壤，且多于 1 kg。样品采集后放入样品袋，并尽快运回实验室在-20 ℃的冰箱中保存待测。

1.2.2 印楝素的提取 准确称取20 g 甘蓝样品放入匀浆机中并加入乙腈100 mL，高速匀浆2 min 后用滤纸过滤，将滤液加入到含有氯化钠(6 g)的量筒中，剧烈震荡数分钟后静置30 min，使乙腈和水分层，吸取上清液50 mL，加入平底烧瓶中，在40 ℃的条件下减压浓缩处理，加V(正己烷)∶V(丙酮)=7∶3的混合液2 mL溶解，待净化。准确称取20 g 土壤加入到三角瓶中，并加入乙腈100 mL，超声提取30 min，过滤，将滤液加入到含有氯化钠(6 g)的量筒中，剧烈震荡数分钟后静置30 min，使乙腈和水分层，吸取上清液50 mL，加入平底烧瓶中，在40 ℃条件下进行减压浓缩处理，其后用甲醇定容到1 mL并经微孔滤膜过滤后，进行测定。

1.2.3 样品净化 预先用V(正己烷)∶V(丙酮)=7∶3的混合液5 mL活化Florisil固相萃取柱，转移提取液到柱上，用V(正己烷)∶V(丙酮)=7∶3的混合液进行洗脱处理，每次5 mL，共洗脱3次，然后在40 ℃条件下用氮吹仪进行浓缩，其后用甲醇定容到1 mL并经微孔滤膜过滤后，进行测定。

1.2.4 液相色谱 色谱柱为Agilent TC-C18(5 μm)，250 mm×4.6 mm；柱温30 ℃；流动相为V(乙腈)∶V(水)=40∶60；流速1 mL·min-1；二极管阵列检测波长217 nm，进样量10 μL。定量方式采用外标法。在上述检测条件下印楝素的保留时间为9.80 min。

2 结果与分析

2.1 印楝素在甘蓝和土壤中的添加回收率及检出限

以200 mg·kg-1印楝素标样测定的标准曲线如图1A所示。在0.5～5.0 mg·kg-1线性范围内，进行添加回收处理，分别在空白甘蓝和空白土壤中，准确添加3个质量分数(0.1、0.5、1.0 mg·kg-1)的印楝素标准溶液，每个质量分数重复5 次，然后测定回收率，添加回收色谱图见图1B，由图1B可知，印楝素峰形好、重现性较好且未见杂质干扰。印楝素在土壤中平均回收率为90.69%～93.32%，相对标准偏差为2.09%～3.46%，在甘蓝中的平均回收率为88.52 %～93.21%，相对标准偏差为2.75%～3.55%(表1)。此方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求。该方法的最小检出量为2 ng，印楝素的最低检出浓度为0.02 mg·kg-1。

图1 甘蓝添加印楝素的高效液相色谱图

Fig.1 HPLC chromatogram of cabbage sample spiked with azadirachtin

表1 印楝素在甘蓝和土壤的添加回收率Tab.1 Recovery rates of azadirachtin in cabbage and soil

2.2 印楝素在甘蓝和土壤中的消解动态

空白对照组的液相色谱图见图2。表2为0.3%(w)印楝素乳油在甘蓝和土壤上的消解动态，当施药量为2.7 g·m-2时，印楝素在甘蓝和土壤中的原始沉积量分别为3.93和0.31 mg· kg-1，药后5 d在甘蓝和土壤中印楝素的残留量分别为0.07和0.06 mg·kg-1，消解率分别为 98.21% 和80.64%。印楝素在甘蓝和土壤中的消解动态符合一级反应动力学，即Ct=C0e-kt，运用DPS进行统计分析后，可以得到印楝素在甘蓝和土壤中的残留消解的动态方程(表2)。由表2可知，印楝素在甘蓝中的半衰期为0.89 d，在土壤中的半衰期为2.40 d。

图2 空白对照的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of control without azadirachtin

Tab.2 Dissipation dynamics of 0.3% azadirachtin EC residue in cabbages and soil

t取样/d甘蓝土壤残留量/(mg·kg-1)消解率/%残留量/(mg·kg-1)消解率/%03.930.310.253.4611.950.296.451.001.8054.190.2616.122.000.8578.370.1938.703.000.3790.580.1454.834.000.1895.410.0970.965.000.0798.210.0680.647.00…………消解方程Ct=4.0251e-0.7775tCt=0.3195e-0.2882t相关系数0.99890.9909F2288270P0.000010.00002半衰期/d0.892.40

3 结论

本研究建立了较为简便的检测印楝素在甘蓝和土壤中残留的方法。试验结果表明，经过此方法处理的样品，液相色谱图峰形良好且该方法的添加回收率及准确度等均符合要求。本研究用2倍的推荐剂量对田间甘蓝进行施药，6 h后印楝素的残留量就已经低于检出限而检测不出。为了进一步获得印楝素在甘蓝上残留降解行为的信息，本研究采用了20倍的推荐剂量施药，施药后1 h在甘蓝上的原始沉积量为3.93 mg·kg-1，半衰期为0.89 d，7 d后已检测不出。施药后1 h在土壤中的原始沉积量为0.31 mg·kg-1，半衰期为2.40 d。印楝素属于植物性杀虫剂，目前国内鲜见印楝素在蔬菜上的MRL和安全使用标准。欧盟则规定印楝素在蔬菜上的MRL为1.0 mg·kg-1，安全间隔期为3 d。根据本研究结果，并参照FAO/WHO和国内农药残留限量标准，可知印楝素属于低毒、低残留农药。但为了保证安全，仍需进一步开展各种试验，多积累数据并结合毒性资料等来制定印楝素在农产品中的MRL值。

[1] 唐艳梅， 黎其万， 刘宏程， 等. 固相萃取-高效液相色谱测定水果中印楝素残留量[J]. 农药， 2011， 50(1): 53-54.

[2] MOHAN K， GOPALAN M， BALASUBRAMANIAN G. Studies on the effects of neem products and monocrotophos against major pests of rice and their safety to natural enemies[J]. Ind J Plant Protect， 1991， 19(1): 23-30.

[3] KRISHNAIAH N V， KUMAP K M， LINGAIAH T， et al. Effect of neem formulations on feeding ofNilaparvatalugens，SogatellafurciferaandNephotettixvirescensof rice[J]. Pest Res J， 2001， 13(2): 235-238.

[4] DAI J， YAYLAYAN V A， RAGHAVAN G S， et al. Multivariate calibration for the determination of total azadirachtin-related limonoids and simple terpenoids in neem extracts using vanillin assay[J]. J Agric Food Chem， 2001， 49(3): 1169-1174.

[5] 李永江， 张毅， 肖为民， 等. 比色法测量印楝种仁提取物中柠檬苦素类物质[J]. 西南农业大学学报(自然科学版)， 2003， 25(2): 150-152.

[6] TANUJA P， VENUGOPAL N， SASHIDHAR R B. Development and evaluation of thin-layer chromatography-digital image-based analysis for the quantitation of the botanical pesticide azadirachtin in agricultural matrixes and commercial formulations: Comparison with ELISA[J]. J AOAC Int， 2007， 90(3): 857-863.

[7] SIDHU O P， KUMAR V， BEHL H M. Variability in neem(Aazadirachtaindica) with respect to azadirachtin content[J]. J Agric Food Chem， 2003， 51(4): 910-915.

[8] 罗应兰， 刘宏程. 超声波固相萃取-高效液相色谱法同时测定茶叶中印楝素及类似物残留量[J]. 农药， 2016， 5(12): 915-917.

[9] THOEMING G， DRAEGER G， POEHLING H M. Soil application of azadirachtin an 3-tigloy-azadirachtol to control western flower thrips，Frankliniellaoccidentalis(Thysanoptera: Thripidae): Translocation and persistence in bean plants[J]. Pest Manag Sci， 2006， 62(8): 759-767.

[10]THOMPSON D G， CHARTRAND D T， KREUTZWEISER D P. Fate and effects of azadirachtin in aquatic mesocosms: Fate in water and bottom sediments[J]. Ecotoxical Environ Saf， 2004， 59(2): 186-193.

[11]CABONI P， CABRAS M， ANGIONI A， et al. Persistence of azadirachtin residues on olives after field treatment[J]. J Agric Food Chem， 2002， 50(12): 3491-3494.

[12]CABONI P， SARAIS G， ANGIONI A， et al. Residues and persistence of neem formulations on strawberry after field treatment[J]. J Agric Food Chem， 2006， 54(26): 10026-10032.

[13]CABONI P， SARAIS G， ANGIONI A， et al. Fate of azadirachtin A and related azadirachtoids on tomatoes after greenhouse treatment[J]. J Environ Sci Health B， 2009， 44(6): 598-605.

[14]SARAIS G， ANGIONI A， LAI F， et al. Persistence of two neem formulations on peach leaves and fruit: Effect of the distribution[J]. J Agric Food Chem， 2009， 57(6): 2457-2461.

[15]王运浩， 季颖， 龚勇， 等. 农药登记残留田间试验标准操作规程[M]. 北京: 中国标准出版社， 2007: 68-72.

【责任编辑 霍 欢】

Degradation dynamics of azadirachtin in cabbage and soil

YANG Xiaoyun1， HUANG Qiliang2， JIANG Tenghui3， XU Hanhong1

(1 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2 Guangdong Vocational and Technotogical School of Environmental Protection, Guangzhou 510655, China; 3 Agricultural Pest Prevention and Control Center of Guangdong Province, Guangzhou 510500, China)

【Objective】 To identify the residual and degradation dynamics of azadirachtin in cabbage and soil after spraying 0.3%azadirachtin emulsifiable concentrate during the growth period of cabbage (Brassicaoleracea)．【Method】Azadirachtin was added with three concentrations of 0.1，0.5 and 1.0 mg·kg-1within the range from 0.05 to 5.00 mg·kg-1. Azadirachtin was extracted from cabbage and soil using acetonitrile assisted with ultrasonic, purificated using a florisil solid phase extraction column, detected by HPLC and quantified by external standard method．【Result】The average recovery rates of azadirachtin in cabbage ranged from 88.52% to 93.21% with relative standard deviations ranging from 2.75% to 3.55%, and the average recovery rates in soil were ranged from 90.69% to 93.32% with relative standard deviations ranging from 2.09% to 3.46%.The half-lives of azadirachtin in cabbage and soil were 0.89 and 2.40 d respectively.【Conclusion】Azadirachtin is an easily degradable pesticide. Application of 0.3% azadirachtine mulsifiable concentrate is safe and recommended.

azadirachtin; emulsifiable concentrate; cabbage; soil; pesticide residue；HPLC

2017- 03- 02 优先出版时间：2017- 06-21

杨晓云(1966—)，男，苗族，副教授，博士，E-mail：yxyhyxy@scau.edu.cn；通信作者：徐汉虹(1961—)男，教授，博士，E-mail：hhxu@csau.edu.cn

国家自然科学基金(20377015)

S481.8

A

1001- 411X(2017)04- 0037- 04

优先出版网址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1924.012.html

杨晓云， 黄其亮， 江腾辉， 等.印楝素在甘蓝及土壤中的消解动态[J].华南农业大学学报，2017,38(4):37- 40.