MMP-1、7、9基因多态性与青海回、汉族胎膜早破相关性*

白玉芳，祁存秀，路 丽，沙仁高娃，王荣华，朱雪玲，巩海风，苏占海

(1.青海大学附属医院产科；2.青海大学研究生院；3.青海大学附属医院供应室； 4.青海大学医学院基础医学研究中心，西宁 青海 810001)

MMP-1、7、9基因多态性与青海回、汉族胎膜早破相关性*

白玉芳1，祁存秀2，路 丽2，沙仁高娃2，王荣华3，朱雪玲2，巩海风2，苏占海4

(1.青海大学附属医院产科；2.青海大学研究生院；3.青海大学附属医院供应室； 4.青海大学医学院基础医学研究中心，西宁 青海 810001)

目的 利用PCR及测序方法分析青海地区回、汉族胎膜早破孕妇MMP-1、7、9基因多态性特点及是否具有民族差异性。方法 提取胎膜早破孕妇和对照组组织DNA，利用PCR和琼脂糖凝胶电泳、测序法，检测基因多态性并行相关分析。结果 MMP-1 rs1799750 G/G、-/G、-/-基因型频率在汉族对照组和胎膜早破组中分别是44.25%、51.33%、4.42%和34.29%、47.14%、18.57%，两组基因型频率分布具有显著差异性(P=0.006)；在回族对照组和胎膜早破组中基因型频率分别是45.98%、50.57%、3.45%和51.72%、34.48%、13.79%，两组基因型频率呈现显著差异性(P=0.005)。MMP-7 rs11568818三种基因型A/A、A/G、G/G在汉族对照组和胎膜早破组中基因型频率分别是60.18%、37.17%、2.65%和84.29%、8.57%、7.14%，两组相比，基因型频率分布具有显著差异性(P=0.000)；回族对照组和胎膜早破基因型频率分布分别是9.77%、39.08%、1.15%和86.21%、6.90%、6.90%，两组基因型频率相比具有显著差异性(P=0.000)。MMP-9 rs3918242 SNP三种基因型C/C、C/T、T/T在汉族对照组和胎膜早破组中基因型频率分布分别是72.57%、26.55%、0.88%和70.00%、28.57%、1.43%，其基因型频率在两组中无显著性差异(P=0.895)；在回族对照组和胎膜早破组中基因型频率分别是71.26%、8.74%、0.00%和70.69%、27.59%、1.72%，两组相比无显著差异性(P=0.468)。结论 MMP-1 rs1799750和MMP-7 rs11568818基因多态性可能与青海汉、回族胎膜早破相关；而MMP-9 rs3918242基因多态性与胎膜早破无关。同时，MMP-1 rs1799750、MMP-7 rs11568818和MMP-9 rs3918242基因频率分布在青海汉、回族对照组和胎膜早破组中无特异性。

MMP基因 基因多态性 胎膜早破 青海 回族 汉族

胎膜早破的发病原因多，近来对其发病机制的研究主要集中在对胎膜本身结构的变化上，而对胎膜本身结构的变化又主要集中在基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)上。胶原的降解主要由MMP介导，当分娩发动后，胎膜组织中MMP活性显著升高，从而加速对间质胶原的降解，影响到胎膜组织结构，从而使胎膜组织的强度下降，导致胎膜破裂[1-3]。

本研究利用PCR及SNP基因分型技术分析MMP-1、7、9基因多态性与青海回、汉族产妇胎膜早破的相关关系，同时分析MMP基因多态性在胎膜早破中的表达是否具有民族特异性，最终为阐明青海回、汉族产妇胎膜早破分子机制提供重要的实验依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象及选择标准

选取2015年8月～2016年12月，在青海大学附属医院、青海红十字医院、青海省人民医院、青海省交通医院收集回族胎膜早破标本58例，回族正常87例；汉族胎膜早破70例，汉族正常113例。胎膜早破纳入标准参照人民卫生出版社第八版《妇产科学》。

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集

在胎盘娩出后5 min 内，于近宫颈的胎膜破口处，无菌剪取胎膜组织(2cm2)，用生理盐水反复冲洗其表面污迹后，置灭菌过的标本收集管中，入 -80 ℃冰箱冻存。

1.2.2 试剂和设备选择

无水乙醇、琼脂糖、电泳缓冲液、基因组DNA提取试剂盒及引物(生工生物公司，上海)；离心机(Eppendorf AG，德国)，恒温箱(琅玕公司，上海)，涡旋器(IKA Laboratory Equipment，荷兰)，电泳仪(六一，北京)，Namedrop 2000 c分光光度计(Thermo Scientific，美国)，凝胶成像系统(Bio-Rad Laboratories，美国)。

1.2.3 基因组DNA的提取

取小块胎膜组织立刻置于液氮中研碎，加入Proteinase K溶液混匀后，恒温箱中放置3 h，至组织溶解；按照基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取，最后用无水乙醇沉淀并提纯DNA，保存于-80 ℃冰箱用于后续实验。

1.2.4 PCR及SNP基因分型分析

PCR所需引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表1。PCR反应为预变性99 ℃ 94 s，94 ℃ 45 s，退火55 ℃～57 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，共35个循环；每次取7 μL PCR扩增产物上样，在1%琼脂糖凝胶上100 V电压下电泳40 min，溴化乙锭染色后通过凝胶成像系统进行照相并保存。最后将PCR扩增产物送上海生工生物有限公司测序并进行SNP技术分型，根据测序结果确定基因型和基因频率。

表1 MMP-1、-7、-9引物

Table 1 The primes of MMP-1，-7 and -9

1.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳检测

提取的组织基因组DNA，上样于1%琼脂糖凝胶，并在200 V电压下电泳30 min 后检测，结果通过凝胶成像系统扫描后保存，以备分析和验证。

1.2.6 统计学处理

数据用 SPSS 17.0软件处理，结果分析采用卡方检验，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 基因组DNA电泳检测

胎膜组织和胎膜早破组织DNA提取后，进行DNA琼脂糖电泳检测，并通过凝胶成效系统照相分析。结果显示，基因组DNA提取成功，条带清晰(图1)。

(M：DNA Marker；1-4：正常孕妇胎膜组织DNA；5-7：胎膜早破孕妇组织DNA)

图1 基因组DNA电泳结果

Figure 1 The results of genome electrophoresis

(M：DNA Marker；左侧1-8为MMP-1引物PCR产物；右侧1-8为 MMP-7引物PCR产物)

2.2 PCR产物检测

通过DAN琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物扩增状态。结果显示，PCR扩增成功，条带较为清晰(图2)。

2.3 SNP基因分型分析

图3 MMP-1rs1799750 基因G/G型变为-/G型

Figure 3 The MMP-1 rs1799750 genotype G/G changed into -/G type

图4 MMP-7 rs11568818基因A/G型变为A/A型

图5 MMP-9 rs3918242基因C/C型变为C/T 型

对SNP基因分型发现，MMP-1 rs1799750基因G/G变为-/G基因型(图3)；MMP-7 rs11568818基因中A/G型变为A/A基因型(图4)，MMP-9 rs3918242基因C/C型变为C/T 基因型(图5)。

其中，MMP-1 rs1799750 SNP三种基因型G/G、-/G、-/-在汉族对照组和胎膜早破组中基因型频率分别是44.25%、51.33%、4.42%和34.29%、47.14%、18.57%，且两组基因型频率分布具有显著差异性(P=0.006)，其基因频率也具有差异性(P=0.018)；在回族对照组和胎膜早破组中基因型频率分别是45.98%、50.57%、3.45%和51.72%、34.48%、13.79%，两组基因型频率呈现显著差异性(P=0.005)，其基因频率分布具有差异性(P=0.019)(表2)。

表2 MMP-1rs1799750基因型分布及基因型频率分析(%)

Table 2 Frequency distribution of MMP-1 rs1799750 genotype and allele(%)

MMP-7 rs11568818 SNP三种基因型A/A、A/G、G/G在汉族对照组和胎膜早破组中基因型频率分别为60.18%、37.17%、2.65%和84.29%、8.57%、7.14%。两组相比，基因型频率分布具有显著差异性(P=0.000)，其基因频率也具有差异性(P=0.016)；回族对照组和胎膜早破基因型频率分布分别为9.77%、39.08%、1.15%和86.21%、6.90%、6.90%，两组基因型频率相比具有显著差异性(P=0.000)，其基因频率分布差异明显(P=0.020)(表3)。

表3 MMP-7 rs11568818基因型分布及基因型频率分析(%)

Table 3 Frequency distribution of MMP-7 rs11568818 genotype and allele(%)

MMP-9 rs3918242 SNP三种基因型C/C、C/T、T/T在汉族对照组和胎膜早破组中基因型频率分布分别为72.57%、26.55%、0.88%和70.00%、28.57%、1.43%，其基因型频率和基因频率在两组中无显著性差异(P=0.895，P=0.683)；同时在回族对照组和胎膜早破组中基因型频率分别为71.26%、8.74%、0.00%和70.69%、27.59%、1.72%，两组相比无显著差异性(P=0.468)，其基因频率在两组中亦无差异(P=0.787)(表4)。

通过比较MMP-1 rs1799750、MMP-7 rs11568818和MMP-9 rs3918242基因型分别在汉族和回族对照组或者胎膜早破组中基因频率的分布，发现各组间无差异性(P>0.05)，说明三个基因的基因频率在青海汉族和回族对照组和胎膜早破组中无民族特异性。

表4 MMP-9 rs3918242基因型分布及基因型频率分析(%)

Table 4 Frequency distribution of MMP-9 rs3918242 genotype and allele(%)

3 讨论

单核苷酸多态性(SNP)是由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，绝大多数SNPs本身虽不是易感性的原因，但在全基因组范围内比较易感和非易感人群之间的SNP图谱，可显示易感人群基因组的结构特点并通过关联分析寻找易感基因。研究显示，胎膜细胞外基质(ECM)的降解失衡是导致胎膜结构薄弱、易于破裂的重要原因，而MMPs在ECM的降解中起着最为重要的作用。在胎盘和胎膜中主要为MMP-1、2、3、7、8、9等[4-6]。胎膜的胞外基质成分包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型胶原，氨基葡聚糖，纤维结合素。其中，Ⅳ型胶原为基底膜的主要成分，在保持膜完整性方面起重要作用。MMP-1和MMP-8可以特异性地作用于胎膜中的Ⅰ型和Ⅲ型胶原，使之降解。MMP-7基因定位于11q21-q22，cDNA长1094 bp，分子量为28 KD。据报道，其启动子区-181位点存在A/G多态性。此位点的A-G突变可使该基因的转录活性增高。因此，我们推测启动子区的SNP可能通过影响MMP-7基因转录活性及蛋白表达水平而影响PROM的发生、发展[7-9]。正常妊娠时MMP-8不会出现在羊水内，但会出现在宫颈组织中，有研究发现[10-11]，宫颈的成熟往往伴随着大量中性粒细胞的侵入，而中性粒细胞可以产生大量MMP-8，从而使维持宫颈硬度的胶原水解，促使宫颈成熟。Shapiro[12-14]认为，胎膜早破的原因是分娩发动后MMP-9被激活，降解胎膜中的IV型胶原，最终导致胎膜破裂。而金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)作为MMPs的特异性抑制因子，能以非共价键形式紧密结合MMPs催化位点，从而抑制了MMPs对细胞外基质的降解[15-17]。因此，这些基因及其SNP分型都与胎膜早破有密切关系。

本研究结果显示，MMP-1 rs1799750和MMP-7 rs11568818基因型频率和基因频率在汉族、回族对照组和胎膜早破组中分布具有显著差异性，暗示其表达分布可能与胎膜早破具有一定相关性；而MMP-9 rs3918242基因型频率和基因频率分别在汉族、回族对照组或者胎膜早破组中分布均没有显著差异性。但分析上述三个位点基因频率后发现，在青海汉族、回族对照组和胎膜早破组中其分布没有民族特异性。

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The correlation study between MMP-1，7，9 gene polymorphism and premature rupture of membranes in the pregnant woman in Qinghai Han- and Hui-Chinese

BAI Yu-fang1，QI Cun-xiu2，LU Li2，SHAREN-Gaowa2， WANG Rong-hua3，ZHU Xue-ling2，GONG Hai-feng2，SU Zhan-hai4

(1.Dept. Of Obstetrics，Qinghai University Affiliated Hospital； 2.Graduate School of Qinghai University；3.Supply Room，Qinghai University Affiliated Hospital； 4.Basic Medical Research Center，Qinghai University Medical College；Xining，Qinghai，810001)

Objective To analyze the polymorphism of MMP-1，7，9 gene in pregnant women with premature rupture of membranes in Han- and Hui-Chinese at Qinghai province by PCR and sequencing.Methods Genome DNA was extracted from preterm premature rupture of membranes and control group.The polymorphism of the gene was analyzed by PCR，agarose gel electrophoresis and sequencing.Results The frequency of MMP-1 rs1799750 G/G，-/G，-/- genotype was 44.25%，51.33%，4.42% and 34.29%，47.14%，18.57%，respectively，in the Han control and the premature rupture of membranes groups，the genotype frequency was significantly different between two groups(P=0.006).Meanwhile the frequency of genotype was 45.98%，50.57%，3.45% and 51.72%，34.48%，13.79% respectively in the control and the premature rupture of membranes group in Hui Chinese，and the genotype frequency was obviously different between two groups(P=0.005).The frequency of MMP-7 rs11568818 A/A、A/G、G/G genotype was 60.18%、37.17%、2.65% and 84.29%、8.57%、7.14% in the Han control and the premature rupture of membranes groups，the genotype frequency was significantly different between two groups(P=0.000).Meanwhile the frequency of genotype was 9.77%，39.08%，1.15% and 86.21%，6.90%，6.90%，respectively，in the control and the premature rupture of membranes group in Hui Chinese，and the genotype frequency was obviously different between two groups(P=0.000).The frequency of MMP-9 rs3918242 C/C，C/T，T/T genotype was 72.57%，26.55%，0.88% and 70.00%，28.57%，1.43% in the Han control and the premature rupture of membranes groups，the genotype frequency was significantly different between two groups(P=0.895).Meanwhile the frequency of genotype was 71.26%，8.74%，0.00% and 70.69%，27.59%，1.72%，respectively，in the control and the premature rupture of membranes group in Hui Chinese，and the genotype frequency was obviously different between two groups(P=0.468).Conclusion The polymorphisms of MMP-1 rs1799750 and MMP-7 rs11568818 may be related to the premature rupture of membranes in Qinghai Han and Hui Chinese，and the polymorphism of MMP-9 rs3918242 gene is not related to premature rupture of membranes.Meanwhile，the allele frequencies of MMP-1 rs1799750，MMP-7 rs11568818 and MMP-9 rs3918242 are not specific between Han and Hui nationality.

MMP Genepolymorphism Premature Rupture of membranes Qinghai Han and Hui nationality

R393

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.006

2016-11-12

※：青海省应用基础研究项目(2016-ZJ-762)；青海省卫生计生委指导性课题(2015) 白玉芳(1972～)，女，回族，青海籍，主任医师、硕士生导师，副教授