银杏叶提取物EGb761对氧化应激下白癜风黑素细胞抗氧化作用的影响

肖 茜 崔婷婷 高天文 王 琳



·临床研究·

·论著·

银杏叶提取物EGb761对氧化应激下白癜风黑素细胞抗氧化作用的影响

肖 茜 崔婷婷 高天文 王 琳

目的： 明确银杏叶提取物(EGb761)对氧化应激下白癜风黑素细胞抗氧化作用的影响。方法： 人正常黑素细胞系PIG1予以H2O2处理建立氧化应激模型，予以不同浓度(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL)EGb761处理，采用MTT法检测PIG1细胞活力，生物化学方法检测脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH),谷胱甘肽过氧化物酶活性及含量，流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平。结果： 与模型组比较，EGb761组PIG1细胞活力、SOD、GSH-Px水平增高，ROS、MDA及LDH的表达水平降低。结论： 银杏叶提取物EGb761可保护黑素细胞抵抗氧化应激损伤。

银杏叶提取物； 白癜风； 氧化应激

银杏树在我国分布非常广泛，银杏叶及银杏果都具有良好的药用价值，早在元代吴瑞著的《日用本草》中其药用价值就有所记载。银杏可以补气养血，健脾益肾。自上世纪六十年代起，国外学者发现银杏叶提取物(Extract of Ginkgo bilobaleaves，EGb761)具有较强的抗氧化作用，可以防治氧化应激引起的多种心脑血管疾病[1]。银杏叶提取物中最主要的活性成分为银杏总黄酮和银杏内酯，具有抗炎，免疫调节及抗氧化等多种作用，它可以减轻氧化应激所致神经元损伤，促进受损神经功能恢复[2]，临床应用于皮肤、心血管、神经、内分泌及免疫系统疾病的治疗[3]。本研究拟采用银杏叶提取物作用于H2O2诱导的黑素细胞氧化损伤，以观察银杏叶提取物对白癜风氧化应激的防治作用，从而为临床白癜风的中药防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 正常人黑素细胞系PIG1细胞，254培养基及人黑素细胞生长添加剂(美国Cascade Biologics/Invitrogen公司)，胎牛血清(美国GIBCO公司)，EGb761(德国Schwabe公司专利/台湾济生公司)，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液 (北京索莱宝科技有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)，4,5-dimethylthiazol-2-基-2,5- diphe-nyltetrazolium溴化物(MTT)购自Sigma公司(密苏里州，美国)。乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(南京，中国)。超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，丙二醛(MDA)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 黑素细胞培养及EGb761最佳作用浓度及时间的筛选 取正常人黑素细胞系PIG1培养，采用含5%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素及100 mg/mL链霉素的254培养基，于37℃、5% CO2孵育箱内培养。PIG1增殖至60%融合时加入0.5 mmol/L H2O2构建氧化应激模型组，分别于H2O2处理24 h后加入50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL的EGb761处理0、12、24、48 h。采用MTT法检测黑素细胞的细胞活力变化。

1.2.2 MTT法检测黑素细胞的活力 实验分为三组，即空白组(未做任何处理)、模型组(0.5 mmol/L H2O2处理PIG1)及EGb761处理组(0.5 mmol/L H2O2处理24 h后加入100 μg/mL EGb761处理48 h)。各组细胞于96孔板培养，待检测时每孔加入MTT检测液 20 μL，将其置于37 ℃、5%的CO2孵育箱中培养4 h；然后再加入DMSO 150 μL并将其置于摇床上10 min，用波长为570 nm的酶标仪测定黑素细胞活力的变化。

1.2.3 细胞内活性氧(ROS)水平的测定 细胞处理同理同上，待检测时收集细胞，加入终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA，置于37 ℃中作用45 min，然后于流式细胞仪488 nm处检测细胞内DCF平均荧光强度(%)。

1.2.4 酶学、生物化学方法检测氧化应激相关产物检测 细胞处理同理同上，按照试剂盒说明检测各组细胞中丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及含量，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行分析，数据以均数±标准差表示。两组数据比较分析，定性资料采用Wilcoxon秩和检验或者卡方检验。定量资料符合正态分布的数据采用单因素方差分析方法，方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验，不符合正态分布的数据采用Wilcoxon秩和检验。实验结果以P<0.05为差异有显著性统计学意义。

2 结果

2.1 EGb761对氧化应激下PIG1细胞活力的影响 MTT检测结果显示，加入不同浓度的EGb761后，黑素细胞的活力可以不同程度的升高，且随着时间的延长细胞活力增加，我们研究发现100 μg/mL的EGb761处理PIG1 48 h时，细胞活力最高(图1)，因此我们后续试验选用100 μg/mL为EGb761的最佳作用浓度，并选定处理48 h为作用时间进行研究。

图1 EGb761对氧化应激下黑素细胞活力的影响(n=10)

2.2 EGb761对氧化应激下PIG1细胞抗氧化能力的影响 MTT检测结果显示，100 μg/mL EGb761可以显著增加H2O2处理下PIG1细胞的活力(图2a)，并且加入EGb761后LDH的释放由13.5%降低到9.4%，显著降低H2O2处理诱导的乳酸脱氢酶(LDH)的释放(图2b)；并且EGb761可显著降低细胞内ROS水平(图3a)；对脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)的含量检测，发现空白组为(8.8±0.5)μmol/mg蛋白，加入H2O2后上升为(22.3±1.5)μmol/mg蛋白，而加入EGb761处理后降低至(17.8±0.7)μmol/mg蛋白(图3)；接下来，我们检测了细胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，发现H2O2处理黑素细胞后，SOD活性由(2.87±0.26)Unit/mg蛋白下调至(1.38±0.2)Unit/mg蛋白，而EGb761处理后可回升至(2.74±0.34)Unit/mg蛋白(图4a)；同样加入EGb761后GSH-Px的活性由模型组的(16.9±0.9)Unit/mg蛋白上升至(24.2±1.8)Unit/mg蛋白(图4b)，表明EGb761可以诱导氧化应激下黑素细胞SOD及GSH-Px活性增强。综合以上结果，表明EGb761可以不同程度的改善黑素细胞的氧化损伤修复，对黑素细胞氧化应激损伤具有保护作用。

图2 a：EGb761对氧化应激下黑素细胞活力影响(n=10，##P<0.01 vs空白组；**P<0.01 vs 模型组)；b：EGb761对氧化应激下黑素细胞LDH释放的影响(n=10，##P<0.01 vs 空白组；**P< 0.01 vs模型组)

图3 a：EGb761对氧化应激下黑素细胞细胞内ROS(n=10，##P< 0.051 vs 空白组；**P< 0.01 vs 模型组)；b：EGb761对氧化应激下黑素细胞MDA生成的影响(n=10，##P< 0.051 vs 空白组；**P< 0.01 vs 模型组)

图4 a：EGb761对氧化应激下黑素细胞抗氧化酶SOD活性的影响(n=10，##P<0.01 vs 空白组；**P<0.01 vs 模型组)；b：EGb761对氧化应激下黑素细胞GSH-Px活性的影响(n=10，##P<0.01 vs 空白组；**P<0.01 vs 模型组)

3 讨论

白癜风是一种由于色素脱失所致的皮肤病。《诸病源候论》中记载：“面及颈身体皮肉色变白，与肉色不同，亦不痒痛，谓之白癜”。白癜风虽易于诊断却难于治疗，影响容貌，给患者带来极大的心理影响和生活压力。本研究期望对白癜风的预防、治疗与调养起到指导作用提供实验依据。

黑素细胞起源于外胚层的神经嵴, 在胚胎发育过程中通过间充质逐渐移行到表皮、毛囊、眼等处。黑素细胞的发育大致经历了神经嵴细胞、成黑素细胞和黑素细胞三个阶段。黑素细胞的数量或功能异常, 将会引起许多色素性皮肤病, 如白癜风或黄褐斑等。在研究白癜风氧化应激的实验中，研究者多把不同浓度的中药加入到H2O2处理的黑素细胞培养中，观察中药在体外对白癜风黑素细胞氧化应激损伤所起的干预作用。

银杏叶提取物是一种广泛应用的天然药物。目前国际上公认的标准银杏叶提取物是按德国Schwabe专利工艺生产的EGb761，它是从银杏叶中经多个步骤分离、纯化而提取出的一种标准化的银杏叶提取物制剂，其中包含24%银杏黄酮苷类和6%银杏萜内酯类成分。Scholtyssek等[4]证实银杏叶提取物中的银杏糖苷B、C、J和M及银杏内酯具有抗氧化的功能。Parsad等[5]将银杏叶提取物用于治疗局限型，进展缓慢的白癜风，研究结果显示：治疗组患者白斑区的扩展较安慰剂组明显减慢，甚至停止。并且25例患者中有10例患者经银杏叶提取液治疗后，取得了显著复色(>75%)或者完全复色。

我们前期实验研究表明[2]，EGb761可以减轻β淀粉样蛋白所致的海马神经元氧化应激损伤，改善神经再生微环境，促进受损神经细胞生长，从而对神经细胞发挥着较强的抗氧化作用。既然黑素细胞起源于神经细胞，且海马神经元也起源于神经细胞，EGb761对海马神经元有保护作用，那么，EGb761能否对黑素细胞氧化应激损伤也起到保护作用呢？国外有学者[6]在临床上应用EGb761治疗白癜风获得了一定的临床疗效，但EGb761治疗白癜风的具体作用机制尚不清楚，目前国内外在EGb761对黑素细胞氧化应激损伤的生物学功能研究方面尚未见报道。我们通过以上研究，发现EGb761可以一定程度的提高黑素细胞的存活率，实验结果表明EGb761可以改善氧化应激相关指标的变化，对抗黑素细胞氧化应激损伤，初步确定了银杏叶提取物对白癜风黑素细胞氧化应激损伤具有保护作用，可以防治氧化应激引起的白癜风等黑素细胞相关疾病，从而为白癜风的药物防治提供新的实验依据及研究思路。

[1] Le Bars PL, Velasco FM, Ferguson JM, et al. Influence of the severity of cognitive impairment on the effect of the Ginkgo biloba extract EGb761 in Alzheimer's disease[J]. Neuropsychobiology,2002,45(1):19-26.

[2] Xiao Q, Wang C, Li J, et al. Ginkgolide B protects hippocampal neurons from apoptosis induced by beta-amyloid 25-35 partly via up-regulation of brain-derived neurotrophic factor[J]. European Journal of Pharmacology,2010,12(647):48-54.

[3] 王涛，许爱娥.银杏叶提取物EGb761神经保护作用研究进展[J].国际皮肤性病学杂志，2010，36(2)：101-103.

[4] Scholtyssek H, Damerau W, Wessel R, et al. Antioxidative activity of ginkgolides against superoxide in an aprotic environment[J]. Chem Biol Interact,1997,106(3):183-190.

[5] Parsad D, Pandhi R, Juneja A. Effectiveness of oral Ginkgo biloba in treating limited, slowly spreading vitiligo[J]. Clin Exp Dermatol,2003,28 (3):285-287.

[6] Szczurko O, Shear N, Taddio A, et al. Ginkgo biloba for the treatment of vitilgo vulgaris: an open label pilot clinical trial[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine,2011,11(21):1472-1481.

(收稿：2016-09-07 修回：2016-09-27)

Effects of ginkgo biloba extract EGb761 on anti-oxidation of melanocytes under oxidative stress in vitiligo

XIAOQian,CUITingting,GAOTianwen,WANGLin.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

Correspondingauthor:WANGLin,E-mail:wanglin@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the effect of ginkgo biloba extract (EGb761) on the anti-oxidation of melanocytes under oxidative stress in vitiligo. Methods: The normal human melanocyte cell line PIG1 was treated with H2O2firstly, followed by different concentrations (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 400 μg/mL) of EGb761. The cell viability was measured by MTT. The levels of lipid peroxide metabolites such as malondialdehyde (MDA), lactic dehydrogenase (LDH) and GSH-Px were measured by biochemical methods. The level of cellular reactive oxygen species (ROS) was detected by flow cytometry. Results: Compared with control group, the expression levels of PIGI cell viability, SOD and GSH-Px were increased, and the expression levels of ROS, MDA and LDH were decreased in EGb761 group. Conclusion: EGb761 has a potential role in protecting melanocytes against H2O2-induced oxidative stress.

ginkgo biloba extract; vitiligo; oxidative stress

第四军医大学西京皮肤医院，陕西西安，710032

王琳，E-mail: wanglin@fmmu.edu.cn