波生坦预防大鼠颈动脉再狭窄与血清血管内皮生长因子相关性研究

张彦红 吴桂平 付鑫 李颖 曲晓婷 王涤非

·论著·

波生坦预防大鼠颈动脉再狭窄与血清血管内皮生长因子相关性研究

张彦红 吴桂平 付鑫 李颖 曲晓婷 王涤非

目的探讨波生坦对大鼠颈动脉再狭窄的预防作用及与血清血管内皮生长因子（VEGF）水平的关系。方法36只Wistar大鼠随机分为假手术组，损伤组和波生坦组。损伤组及波生坦组模拟临床PTCA过程行左颈总动脉球囊损伤，波生坦组给予波生坦100 mg/（kg·d）灌胃（术前1 d直至处死）。在此基础上观测术后7 d、14 d时内膜面积管腔狭窄指数，并于术前及术后1周测定血清VEGF水平。结果波生坦组术后14 d血管内膜面积及管腔狭窄指数显著低于损伤组（P＜0.001）。术后7 d损伤组、波生坦组血清VEGF水平较术前显著升高；波生坦组VEGF增幅高于损伤组，且术后7 d血清VEGF水平与管腔狭窄指数呈线性负相关。结论波生坦组可通过抑制血管内膜过度增生、升高血清VEGF水平预防再狭窄，有利于术后血管再内膜化。

波生坦； 再狭窄； 动脉成形术； 血管内皮生长因子

经皮冠状动脉腔内成形术（Percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）已成为冠心病血管重建的重要手段，然而术后再狭窄发生率仍较高。再狭窄的形成是一个复杂的病理生理过程，包括血管弹性回缩、炎性反应、基质沉积、血管内皮损伤诱发的血管重塑、血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）过度增殖在内的诸多因素参与，其中内皮损伤是再狭窄发生的始动因素［1-2］。血管内皮生长因子 （vascular endothelia growth factor，VEGF）是一种糖蛋白，可以高效、特异地促进内皮细胞分裂和增殖，使血管内皮细胞迅速修复，并发挥抗血小板聚集、释放一氧化氮（NO）、间接抑制VSMC增殖和移行的作用。波生坦是一种非肽类非选择性内皮素受体阻断剂，本研究就波生坦对大鼠颈动脉再狭窄的影响及其与VEGF水平的关系进行分析，现报道如下。

材料与方法

一、实验动物

健康雄性 Wistar大鼠 36只，体重为 330～450 g，购自中国医科大学动物实验室。

二、实验试剂、药品与器材

1.波生坦：购自爱克泰隆药品公司，批号：070312。

2.PTCA球囊导管（1.5 mm×20 mm）、冠状动脉PT导丝，购自Cordis公司。

3.大鼠VEGF试剂盒，购自武汉博士德公司。

三、分组、造型制备与药物干预

选取健康雄性Wistar大鼠36只，随机分为假手术组、损伤组与波生坦组，每组12只。参照Clowes AW［3］方法模拟临床PTCA制备颈总动脉球囊损伤模型：将实验大鼠（损伤组，波生坦组）禁食8 h后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，尾静脉注射肝素100 u/kg。沿中线切开颈部皮肤，在颈前三角区暴露左颈总颈内，颈外动脉，分离颈外动脉，结扎颈外动脉远段，用丝线暂时阻断颈总动脉近心端血流，自颈外动脉血管剪一“V”型小切口，置入导丝并插入近膈肌水平，沿导丝送入PTCA球囊导管至颈总动脉约3 cm。肝素盐水充盈球囊，予1.5 atm力扩张30 s，缓慢回抽球囊至颈总动脉分叉处，间歇60 s，重复3次，剥离内膜，结扎颈外动脉近段，查看颈总动脉及颈内动脉搏动良好后缝合皮下组织及皮肤。术后常规肌注青霉素预防感染。假手术组仅暴露分离左颈总，颈内及颈外动脉，之后缝合皮下组织及皮肤，喂食普通饲料，自由饮水。波生坦组大鼠自术前1天直至处死给予波生坦组100 mg/（kg·d）灌胃，假手术组和损伤组给予等量蒸馏水灌胃直至处死。

四、血清VEGF测定

术前及术后1周所有大鼠于尾静脉采血1 ml，离心取血清-70℃保存，按说明书严格操作，ELISA法测定血清VEGF值。

五、取材

术后7 d、14 d分批取材，首先经尾静脉注射5%Evan′s bule一生理盐水标记无内膜覆盖血管。30 min后用4%多聚甲醛以13.3 kPa后给进行灌注固定，解剖并游离左右侧颈总动脉，切取左侧颈总动脉中段蓝染区，行低温石蜡垂直定向包埋，并以5μm厚度切片，常规HE染色。

六、动脉壁内膜面积的测量及狭窄指数的测定

按照组织学划分，内膜弹力膜以内为血管内膜，内外弹力膜之间为中膜。在5X物镜下将完整的血管横切面HE染色图像摄入计算图像分析系统中（江苏捷达图象分析软件），随机选取动脉蓝染段3个切面分析，取平均值。测量血管内膜面积（NIA）、内弹力板围绕面积（NILA）并计算管腔狭窄指数（SI），SI＝NIA/IELA。

七、统计学分析

采用统计学软件包SPSS 11.0进行方差分析处理，所得数据以±s表示。组间比较采用t检验，自身前后比较采用对照t检验，变量间关系，采用相关分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

36只大鼠分别因术中出血死亡1例，插入颈动脉断裂未完成造模1例，余22只大鼠成功建模：假手术组12只，损伤组11只，波生坦组11只。

一、术后内膜面积比较

术后7 d损伤组与波生坦组内膜面积比较差异无统计学意义（P＞0.05）；术后14 d损伤组与波生坦组内膜面积均较术后7 d显著增加（P＜0.001），但术后14 d波生坦组内膜面积及管腔狭窄指数较损伤组显著减小（P＜0.01）。见表1、表2。

表1 术后7 d、14 d内膜面积比较（mm2，±s）

表1 术后7 d、14 d内膜面积比较（mm2，±s）

注：与损伤组相同时间点比较，aP＜0.001；与本组术后7 d比较，bP＜0.001

组别 例数 术后7 d 术后14 d损伤组 12 0.031±0.007 0.106±0.009b波生坦组 12 0.031±0.006 0.103±0.011ab

表2 术后14 d内膜面积及管腔狭窄指数（SI）比较（±s）

表2 术后14 d内膜面积及管腔狭窄指数（SI）比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与损伤组比较，bP＜0.01

组别 例数 内膜面积（mm2）SI假手术组12 0.019±0.00 0.107±0.023损伤组 12 0.106±0.009 0.513±0.036a波生坦组 12 0.103±0.011 0.302±0.045b

二、血清VEGF水平比较及与术后14 d管腔狭窄指数的相关性

术前3组血清VEGF水平差异无统计学意义（P＞0.05）。术后7 d损伤组、波生坦组血清VEGF水平较术前显著升高（P＜0.01），波生坦组VEGF升高幅度大于损伤组（P＜0.01）。术后7 d时VEGF水平与14 d时管腔狭窄指数成负相关（r＝-0．972，P＜0．01）。见表3、表4。

表3 术前、术后7 d血清VEGF水平比较（pg/m l，±s）

表3 术前、术后7 d血清VEGF水平比较（pg/m l，±s）

注：与同组术前比较，aP＜0.01；与损伤组比较，bP＜0.01

组别 例数 术前 术后7 d假手术组12 26.72±4.22 26.69±4.20损伤组 12 26.83±6.01 76.22±15.2a波生坦组 12 27.63±6.27 133.52±12.75b

表4 术后7 d VEGF水平与14 d SI的关系（±s）

表4 术后7 d VEGF水平与14 d SI的关系（±s）

组别 例数 术后7 d VEGF（pg/ml） 术后14 d SI（mm2）损伤组12 76.22±15.2 0.513±0.036波生坦组12 133.52±12.75 0.302±0.045

讨 论

冠脉介入治疗术后再狭窄的发生是涉及血管弹性回缩。炎症反应，基质沉积，血管重塑，血管平滑肌细胞过度增殖等多因素，多环节的复杂病理生理过程。研究表明PTCA过程中造成的内皮损伤是再狭窄发生的始动因素。临床以上抗血管平滑肌细胞增殖为目的的治疗，如药物涂层支架及内放射支架的使用在一定程度上解决了血管的弹性回缩并通过抑制VSMC的过度增殖降低了再狭窄的发生率，但同时也抑制了内皮细胞的正常增殖，有研究发现血管内放射及雷帕霉素防治再狭窄过程中出现内皮修复延迟［3-4］，由此产生的晚期血栓形成、支架内膜化不完全、炎症反应，引发了人们对药物涂层支架远期疗效的质疑。所以针对再狭窄发生的始动因素-内皮损伤的治疗可有效地促进内皮修复，改善内皮功能而达到预防再狭窄的目的。

VEGF是一种糖蛋白，主要由血管内皮细胞和单核巨噬细胞产生，它能够高效、特异地促进内皮细胞分裂，增殖，抑制多种因素导致的内皮细胞凋亡，增加内皮细胞对过氧化物的耐受性，使血管内皮细胞迅速修复并发挥功能：扩张血管，抑制血小板聚集，抗血栓，间接抑制VSMC增殖和移行，防止炎症细胞浸润和有害物质透入，并促进血管内皮细胞合成和释放NO，进一步发挥扩张血管，抑制血小板粘附、聚集，抑制血细胞粘附及VSMC增生和移行的作用［5］。已有实验证实，VEGF及其基因能加速动脉成形术后的血管内皮的修复，使血栓形成及血栓性闭塞减少，并抑制内膜增生［6］。

波生坦是一种非肽类非选择性内皮素受体拮抗剂，它可对抗内皮素强烈的缩血管作用和促血管平滑肌增生的作用。本实验显示波生坦组14 d的内膜面积及管腔狭窄指数均明显低于损伤组，提示波生坦可有效抑制血管新生内膜的过度增生。本实验同时显示损伤组和波生坦组术后7天时血清VEGF浓度显著高于术前，且波生坦组VEGF升高幅度大于损伤组，提示球囊损伤后通过VEGF的升高，以加速损伤内皮的修复。本实验显示术后7 d波生坦组血清VEGF水平与术后14 d管腔狭窄指数呈负相关，提示早期升高VEGF水平可降低管腔丢失，预防再狭窄，而波生坦在一定程度上具有升高VEGF的作用，但具体机制尚不明确。综上所述，本实验证实波生坦通过抑制动脉新生内膜的过度增生，升高血清VEGF水平，可有效预防再狭窄，并有利于介入术早期再内膜化。如相关大规模临床实验最终能证实该作用，将有助于提高冠脉介入术的疗效。

［1］ Bittl JA.Advances in coronary angioplasty［J］.N Engl JMed，1996，335：1290-1297.

［2］ Kearrey M，Pieczek A，Haley L，et al.Histopathology of in-stent restenosis in patients with peripheral artery disease［J］.Circulation，1997，95：1998-2013.

［3］ Farb A，shroffs，John M，et al.Late arterial responses（6 and 12 months）after（32）p beta-emitting stent placement：sustainded intimal suppression with incompelte healing［J］.Circulation，2001，103（14）：1912-1919.

［4］ Guba M，von Breitenbuch P，Stein bauer M，et al.Rupamycin inhibits primary andmetastatic tumor growth by antiangiogenesis：involvement of vascular endothelial growth factor［J］.Nat Med，2002，8（2）：128-135.

［5］ 刘启功，陆再英.血管内皮生长因子基因预防PTCA后再狭窄的前景［J］.心血管病学进展，2000，21（1）：33-36.

［6］ Asahara T，Bamtera C，Pastore C，et al.Lucal delivery intimal hyperplasis in ballon-injured rat carotid artery［J］.Circulation，1995，91：2793-2799.

张彦红，吴桂平，付鑫，等.波生坦预防大鼠颈动脉再狭窄与血清血管内皮生长因子相关性研究［J/CD］.中华心脏与心律电子杂志，2017，5（1）：44-46.

Effect of Bosentan on Carotid A rtery Restenosis in Rat and Correlation of Serum VEGF

Zhang Yanhong，Wu Guiping，Fu Xin，Li Yin，Qu Xiaoting，Wang Difei．
Department of Cardiology，Shenzhou Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110002，China

Zhang Yanhong，Email：yhzhang＠126．com

ObjectiveTo investigate the effect of Bosentan on carotid artery restenosis in rat and correlation of serum vascular endothelia growth factor（VEGF）.Methods36 Wistar rats were divided randomly into 3 groups：control group，injured group and Bosentan group.Bosentan was administrated intragastricly to rats of Bosentan group.The balloon catheter injury was performed on left common carotid artery of rat by imitating the process of angioplasty.After 7 days，14 days neointimal area（NIA）and stenosis index（SI）was calculated.Before and 7days after balloon injury，serum VEGF were detected.ResultsNIA and SI of Bosentan group were significantly decreased compared with injury group（P＜0.001）.Serum VEGF level significantly increased 7days after balloon injury both in injure group and Bosentan group.The increase rang in Bosentan group was higher than that in injury group（P＜0.01）.The serum VEGF level 7days after injury had linearly negatiuve correlation with SI.ConclusionBosentan is effective on artery restenosis by inhibiting neointimal hyperplasis and increasing the serum VEGF level.

Bosentan； Restenosis； Angioplasty； VEGF

10.3877/cma.j.issn.2095-6568.2017.01.013

110002 沈阳医学院沈洲医院心血管内科

张彦红，Email：yhzhang＠126.com