醒脑静联合丁苯肽对脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

闫瑞云 王善军 王雁



醒脑静联合丁苯肽对脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

闫瑞云 王善军 王雁

目的 观察醒脑静、丁苯酞及二者联合分别对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响。方法 60只雄性wistar大鼠(250±20) g采用改良线栓法制作脑缺血再灌注损伤模型(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)，随机分为4组，即模型组、醒脑静组、丁苯酞组、醒脑静联合丁苯酞(联合用药)组，每组又分为6、24、72 h三个亚组；通过原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测神经细胞凋亡情况，采用免疫组化法观察大鼠脑缺血再灌注各个时间点Bcl-2、Bax的表达水平。结果 (1)模型组手术对侧大脑半球偶见凋亡细胞，病灶区可见大量神经细胞凋亡。丁苯酞用药组、醒脑静用药组凋亡细胞数明显减少，醒脑静联合丁苯酞组凋亡细胞数最少(P<0.05)；(2)丁苯酞组及联合用药组Bcl-2阳性表达水平较模型组均有提高，联合用药组Bcl-2阳性表达水平在各时间点均最高(P<0.05)；丁苯酞组及联合用药组Bax阳性表达水平较模型组均有降低，联合用药组Bax阳性表达水平最低(P<0.05)。结论 (1)醒脑静、丁苯酞及二者联合均可能通过抑制脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡来实现神经细胞保护作用，其中二者联合效果最佳；(2)丁苯酞可能通过增加脑缺血再灌注损伤大鼠Bcl-2表达，减少Bax表达的方式来减少神经细胞凋亡，从而减轻脑缺血再灌注损伤；(3)醒脑静本身不能对Bcl-2、Bax的表达水平产生影响，但其可能通过增强丁苯酞作用的方式影响Bcl-2、Bax的表达，从而减轻脑缺血再灌注损伤。

脑缺血再灌注损伤 Bcl-2 Bax 凋亡

缺血性脑血管病(CVD)的超早期溶栓是目前最有效的措施，但溶栓成功后的患者在一定时间后其神经系统功能不但恢复欠理想，部分出现了更加严重的脑功能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤(reperfusion damage)。脑缺血再灌注损伤机制十分复杂，目前尚不十分清楚。目前临床上针对神经细胞凋亡及可能引起的神经功能障碍的治疗常采用神经营养或脑保护药物，常用的神经保护药物如自由基清除剂、神经营养剂、通道阻断剂、兴奋性氨基酸受体阻断剂等，但效果往往难以尽如人意。因此，新型神经保护药物的研制及已有药物的联合应用成为可能的选项。

醒脑静作为临床常用的中成药，具有清热解毒、凉血活血、开窍醒脑，常用于脑栓塞、脑出血急性期、颅脑外伤等。 丁苯酞为人工合成的消旋正丁基苯酞，与天然的左旋芹菜甲素的结构相同。相关研究显示，丁苯酞对急性缺血性脑卒中患者中枢神经功能的损伤有改善作用，可促进患者神经功能缺损的改善。丁苯酞可阻断缺血性脑卒中所致脑损伤的多个病理环节，具有较强的抗脑缺血作用。二者作为临床常用药，是西药与传统的中医药的有机结合，被广大医务人员广泛接受，然而其具体疗效及可能的作用机制尚不明确，相关研究较少。

本研究从临床常用药物醒脑静及丁苯肽入手，观察其对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的影响，从而推断其可能的作用通道。

1 对象与方法

1.1 研究对象

健康成年雄性Wistar大鼠60只，体重230～270 g，由山东省实验动物中心提供。

1.2 实验设计

将60只成年雄性wistar大鼠(250±20) g随机分为4组，即模型组(n=15)、醒脑静组(n=15)、丁苯酞组(n=15)、醒脑静联合丁苯酞(联合用药)组(n=15)，每组又分为6、24、72 h三个亚组。

1.3 药品

醒脑静注射液(国药准字Z41020664；产品批号为20141207；规格为10 mL)；丁苯酞氯化钠注射液(国药准字H20100041；产品批号为618151007；规格为100 mL，25 mg)

1.4 模型制作及干预

采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，并于缺血2 h后实现再灌注损伤。干预：各组采用腹腔注射的方法给药，模型组：生理盐水 15 mL/kg；醒脑静组：醒脑静注射液5 mL/kg+生理盐水10 mL/kg；丁苯酞组：丁苯酞注射液10 mL/kg+生理盐水5 mL/kg；醒脑静联合丁苯酞组：醒脑静5mL/kg+丁苯酞注射液10 mL/kg。

1.5 观察指标

1.5.1 TUNEL染色阳性细胞及检测 镜下细胞核颜色呈棕黄色，形态固缩，胞体缩小的为阳性细胞(即凋亡细胞)。TUNEL染色阳性细胞计数：每只大鼠取3张切片(各组各时间点的每只大鼠采取相似的3个部位)，每张切片采集高倍镜下(10×40倍)随机的3个非重叠视野，记数每个视野中的100个细胞中凋亡细胞个数，从而计算凋亡阳性细胞率(凋亡阳性细胞率=凋亡细胞数/细胞总数×100%)，取其均数。

1.5.2 免疫组化染色阳性细胞及检测 Bcl-2、Bax阳性细胞与背景比较，胞浆、胞膜染成棕黄色。Bcl-2、Bax阳性细胞计数：在400倍光镜下每张切片随机取缺血侧大脑皮质3个不重叠高倍视野，计数其阳性细胞数，每只大鼠取3张相似部位切片计数，取其均数。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 TUNEL染色阳性的凋亡细胞 凋亡细胞数总体趋势是模型组最高，醒脑静组及丁苯酞组不同程度降低，醒脑静联合丁苯酞组最低，其中丁苯酞组与模型组，联合用药组与模型组及丁苯酞组与联合用药组之间在6、24、72 h时间点的差异均明显(P均<0.05)，而醒脑静组与模型组的比较仅24 h时间点上有明显差异，6 h与72 h时间点无明显差异(P>0.05)(表1)。

表1 大鼠脑缺血再灌注后凋亡阳性细胞率的变化，%)

注：与模型组比较，▲P<0.05，◆P>0.05，▽P<0.05；与醒脑静组比较，★P<0.05；与丁苯酞组比较，※P<0.05

2.2 Bcl -2 和Bax 蛋白表达水平 丁苯酞组及联合用药组在6、24、72 h时间点Bcl-2阳性表达水平较模型组均有提高(P均<0.05)，联合用药组Bcl-2阳性表达水平在各时间点均最高(P<0.05)。醒脑静组在各时间点与模型组比较无明显差异(P>0.05)。丁苯酞组及联合用药组在6、24、72 h时间点Bax阳性表达水平较模型组均有降低(P<0.05)。联合用药组Bax阳性表达水平在各时间点均最低(P<0.05)。醒脑静组在各时间点与模型组比较均无明显差异(P均>0.05)。

Bcl-2阳性表达水平于6 h明显升高，24 h达峰值，Bax于6 h表达减少，24 h达最低值；联合给药组Bcl-2阳性表达水平在各时问点最高，而Bax阳性表达最少(P<0.05)(表2～3)。

表2 大鼠脑缺血再灌注后Bcl-2 阳性表达水平，个/每个400倍视野)

注：与模型组比较，▲P>0.05，▽P<0.05；与醒脑静组比较，◆P<0.05，★P<0.05；与丁苯酞组比较，※P<0.05

表3 大鼠脑缺血再灌注后Bax阳性表达水平，个/每个400倍视野)

注：与模型组比较，▲P>0.05，▽P<0.05；与醒脑静组比较，◆P<0.05，★P<0.05；与丁苯酞组比较，※P<0.05

3 讨 论

缺血性脑血管病(ICVD)是一种常见的临床疾病，其发病率呈上升趋势，致残率较高，因此研究脑缺血后的病理生理过程及对其病理过程进行干预研究有其理论及现实意义。缺血性脑损伤是一个多环节、多反应的复杂病理生理过程。在人体和动物中脑组织对缺血、缺氧导致的损害都非常敏感，相关研究显示阻断血流30 s脑代谢即发生改变，1 min后神经元功能活动停止，缺血超过5 min可发生脑梗死。脑缺血后神经元的损伤也是具有选择性的，轻度缺血时仅有某些种类的神经元丧失，完全持久、长时间的缺血可导致各种神经元、胶质细胞及内皮细胞均有坏死。因此，脑缺血时脑组织损害的程度与缺血时供血保留的水平及缺血持续时间有关。脑梗死的治疗无外乎重新建立脑血供，然而临床及实验均证明在脑缺血中断后如果脑血流再通超过有效的时间窗，脑损伤可继续加剧，产生所谓的缺血-再灌注损伤。 再灌注损伤机制复杂，已有的研究显示其机制主要包括自由基过度形成和自由基“瀑布式”连锁反应、神经细胞内钙超载、兴奋性氨基酸细胞毒性作用、炎症级联反应、血管内皮细胞功能紊乱等。具体过程并不十分明确。

1972 年 Kerr首次提出了细胞凋亡这一概念，细胞凋亡被认为是与细胞有丝分裂发挥完全相反作用，是神经细胞的程序性、主动性死亡，是可以控制细胞缺失的一种机制。其过程十分复杂，有一系列酶参与的过程，当机体的正常细胞在受到生理、病理性刺激或者环境剧烈变化时诱导或抑制细胞凋亡的发生。既往研究证实凋亡可以发生在缺血性脑血管病阿尔茨海默病、帕金森综合症等。近年来脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡相关方面的研究再次成为热点。Bcl-2 家族在凋亡蛋白家族中起着举足轻重的作用，其中包括抗凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-x L 和促凋亡蛋白 Bax 和 Bak。 细胞凋亡发挥作用具有内在途径和外在途径两种，即细胞表面死亡受体途径和线粒体途径。Bcl-2 家族蛋白多定位于线粒体，多通过内在途径发挥作用。Bcl-2 家族蛋白在调节细胞色素 C 释放中发挥核心作用。Bcl-2 家族调控细胞凋亡的发生发展取决于促进抗凋亡蛋白-Bcl-2 和抑制凋亡蛋白-Bax 的相对浓度[1]。许多研究表明，过度表达 bcl-2 能够减少脑梗死动物模型中缺血性脑损伤[2-3]，其主要作用是抑制细胞凋亡，是神经系统的主要神经保护性蛋白，其表达越多，脑保护作用越强[4]，而bax表达越多，脑损伤越重。因此，检验bcl-2与bax的水平可反映细胞凋亡的水平。

醒脑静作为临床常用的中成药，具有清热解毒、凉血活血、开窍醒脑。常用于脑栓塞、脑出血急性期、颅脑外伤等。但具体的作用机制及作用效果研究较少。在中医中药方面Lv HD及Jia D等[5-6]在研究丹酚酸B及三七多糖对脑缺血后的神经系统保护时也发现可能与抑制bax表达或提高bcl-2的表达有关。那么临床常用中成药醒脑静对神经系统的保护是否也有类似的影响呢？该方面的研究较少。

近年来，Junga YS及Hua K等[7-8]的研究显示普伐他汀、依达拉奉、丁苯肽等药物降低脑缺血后神经元损伤可能与通过抑制bax表达或提高bcl-2的表达有关。在脑缺血或脑缺血再灌注损伤治疗方面神经细胞的凋亡控制的程度可能直接关系预后。丁苯酞是从芹菜籽中提取出来的有效成分，dl- 3-正丁基苯酞( dl-NBP) 学结构是左旋体，后经人工合成为消旋体。其主用作用靶点为血管内皮，具有稳定神经血管单元[9]、促进血管生成、增加灌注血管数、减少梗死体积、改善神经功能缺损的作用[10]。丁苯酞在缺血性脑血管病及脑缺血再灌注损伤中的应用越来越广泛，其疗效被广大医务工作者及实验机构认可，广泛应用于临床。其可能的作用机制是通过抑制神经细胞凋亡来实现神经保护作用的。但其对神经细胞凋亡的影响程度及可能的作用通道尚不明确。

通过研究醒脑静、丁苯酞及二者联合应用对脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及bcl-2和bax表达的影响，不仅可以通过对神经细胞凋亡的研究来反映上述药物的临床疗效、研究二者的相互作用，为临床是否联合该两种药物提供理论依据；也可以通过对凋亡蛋白bcl-2/bax的研究来推断可能的作用通道，必将对新的靶向作用药物的研究提供新的实验依据。

本研究显示模型组、醒脑静组、丁苯酞组及联合用药组梗死周围组织明显水肿、坏死，可见许多深染、固缩核细胞及凋亡细胞。TUNEL染色阳性的凋亡细胞数总体趋势是模型组最高，醒脑静组及丁苯酞组不同程度降低，醒脑静联合丁苯酞组最低。这说明醒脑静、丁苯酞具有对抗脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的作用。二者联合应用对抗神经细胞凋亡的作用最强，优于单用醒脑静和丁苯酞。其中丁苯酞组与模型组、联合用药组与模型组及丁苯酞组与联合用药组之间在6、24、72 h时间点的差异均有统计学意义，而醒脑静组与模型组的比较仅24 h时间点上差异有统计学意义，6 h与72 h时间点差异无统计学意义。说明醒脑静抗神经细胞凋亡作用是有限的，单用时该药物在24 h的时候作用显现。丁苯酞的抗凋亡作用优于醒脑静。但联合应用醒脑静及丁苯酞会令该两种药物的抗凋亡作用明显增强。二者联合应用时抗凋亡作用的增强是单纯的叠加效应，还是两种药物有某种协同作用呢？这个问题可以从上述药物对bcl-2/bax表达的影响来回答。

丁苯酞组及联合用药组在6、24、72 h时间点Bcl -2阳性表达水平较模型组均有提高，而同时Bax阳性表达水平较模型组均有降低。这可能与神经细胞凋亡有关。说明丁苯酞及联合应用醒脑静和丁苯酞可能是通过影响凋亡蛋白bcl-2/bax的表达水平来影响神经细胞凋亡，从而起到脑保护作用。至少抗凋亡是其作用靶点之一。醒脑静组在各时间点与模型组比较，Bcl-2、Bax阳性表达水平差异无统计学意义，说明醒脑静不是通过影响凋亡蛋白bcl-2/bax表达的途径实现抗凋亡作用的。其较弱的抗神经细胞凋亡作用另有通道，有待下一步试验中进一步研究。联合用药组Bcl-2阳性表达水平在各时间点均最高，Bax均最低，说明虽然醒脑静本身不具有影响凋亡蛋白bcl-2/bax表达的作用，但其可通过增强丁苯酞作用的方式来实现对抗神经细胞凋亡，实现脑缺血再灌注损伤后的脑保护作用。这说明临床上联合应用醒脑静及丁苯酞是有实际作用的，联合用药效果更佳，并且该作用是通过醒脑静增强丁苯酞作用的方式实现的。

另外，Bcl-2阳性表达水平于6 h明显升高，24 h达峰值，Bax于6 h表达减少，24 h达最低值；联合给药组Bcl-2阳性表达水平在各时问点最高，而Bax阳性表达最少。这提示通过该通道的作用来实现对抗神经细胞凋亡作用，早期干预(24 h以内)可能效果更佳。

总之，丁苯酞可明显减少大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡，具有一定的神经保护作用; 其神经保护作用可能是通过上调 bcl-2 的表达、下调Bax的表达来实现的。醒脑静具有有限的抑制神经细胞凋亡作用，但其具体的作用机制不详。醒脑静可通过增强丁苯酞影响凋亡蛋白bcl-2/bax表达的方式抑制神经细胞凋亡，从而起到脑保护作用。本实验结果提示神经营养药物可以通过抑制神经细胞凋亡方式而起神经保护作用，这就为临床上缺血性脑血管疾病的防治提供了新思路。

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(2016-10-09收稿)

Effects of Xingnaojing injection combined with butylphthalide(NBP) on the expression of apoptosis after cerebral ischemia reperfusion

YanRuiyun,WangShanjun,WangYan,etal.

QingdaoUniversityMedicalCollege,QingDao26600

Objective To observe the effects of Xingnaojing injection, butylphthalide(NBP) and combined with them on the expression of apoptosis,Bcl-2 and Bax in rats after cerebral ischemia reperfusion. To investigate whether there are protective effects on brain, and to explore its possible mechanism.Methods Sixty male Wistar rats by modified suture method for cerebral ischemia reperfusion (MCAO) were randomly assigned into four groups: model group, Xingnaojing group, butylphthalide(NBP) group,combined with NBP and xingnaojing(combination) group. Each group was divided into three subgroups: 6 h, 24 h and 72 h. The apoptosis of nerve cells was detected by transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling (TUNEL), and the expression of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry.Results In the model group, a large number of apoptotic cells were observed in the lesion area. In NBP group and Xingnaojing group,the number of apoptosis were significantly reduced, the combination group at the least level (P<0.05). In NBP group and combination group,the expression of bcl-2 was significantly lower than that in the model group. The combination group at the highest level, at each time point (P< 0.05). The expression of bax was to the contrary (P< 0.05).Conclusion The use of xingnaojing, NBP and combination of the two have neuroprotective effects through the inhibition of nerve cell apoptosis, in which the combination group do the best. NBP can relieve the brain damage by up-regulating the expression of Bcl-2 and down-regulating the expression of Bax. Xingnaojing injection itself cannot influence the expression of bcl-2 and Bax. But it can enhance the effect of NBP to the expression of bcl-2 and Bax. It can indirectly alleviate cerebral ischemia reperfusion injury.

Cerebral ischemia reperfusion injury Bcl-2 Bax Apoptosis

26600 青岛大学医学院[闫瑞云(现工作于山东省昌乐县人民医院神经内科)]；潍坊市益都中心医院神经外科(王善军)；青岛大学附属医院神经内科[王雁(通信作者)]

R743.3

A

1007-0478(2017)02-0099-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.02.004