糖尿病合并去势大鼠骨微结构退化的研究

蔡吓明 魏建銘

福建莆田学院临床医学院，福建 莆田 351100

在我国约有80%的60岁以上的老年人群患有骨质疏松症(osteoporosis，OP)，女性患病人数是男性的6倍，有40%～50%的50岁以上妇女可能发生绝经后骨质疏松性骨折[1]。除了增龄、缺钙和女性绝经等已知的OP危险因素外，血糖升高与OP 密切相关[2]。有研究发现糖尿病会让女性的绝经期提前，并增加了她们罹患骨骼疾病的风险。而骨强度下降是OP 的根本特点[3]，骨强度取决于骨密度(bone mineral density，BMD)和骨质量，BMD测定是世界上公认的骨质疏松症的诊断金标准，本文通过建立绝经期糖尿病骨质疏松症大鼠模型，旨在探讨糖尿病合并去势大鼠骨微结构退化、OP发生情况及其影响因素。

1 材料和方法

1.1 模型的建立

选用清洁级3月龄SD雌性大鼠40只，体重200～220 g，由福州吴氏动物中心提供。去势组切除大鼠双侧卵巢，假手术组手术过程不切除卵巢而切除小块脂肪组织。STZ(美国SANLAN公司提供)诱发糖尿病。STZ用0.1 mol/L枸櫞酸缓冲液配成1%(g/mL)浓度，按60 mg/kg左下腹腔内注射。72 h后取尾血用One Touch血糖测定仪测血糖，凡血糖≥167 mmol/L即为糖尿病。糖尿病合并去势组用去卵巢与链脲佐菌素复合造模。随机分为对照组、假手术组、去势组、糖尿病组和糖尿病合并去势组，6 w和15 w后测定。

1.2 骨标志物检测

10%水合氯醛麻醉后，腹主动脉采血，-80℃冰箱保存。采用罗氏COBASE601全自动电化学发光免疫分析仪检测骨标志物(β-胶原降解产物)，严格按照说明书进行操作。

1.3 骨密度值检测

采用Lunar iDNA型双能X线骨密度仪(美国通用)检测，测量第4腰椎骨密度和股骨近端，由2名经验丰富的放射科医生进行共同确诊，用自带的软件进行数据分析。

1.4 骨组织计量学指标比较

麻醉取股骨，入4%多聚甲醛固定，逐级脱水脱脂后，再以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，制成蜡块，连续切片(厚度4 μm)。苏木精-伊红(HE)染色，光镜(日本Olympus BX51T-PHD-J11)观察骨细胞与细胞外基质分布。随机选取，高倍镜视野下观察骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间距(Tb.SP)，同样要求在不同的视野各测定一次，取平均值。

1.5 Van Gieson氏胶原纤维染色

切片以Van Gieson氏进行胶原纤维染色，光镜下观察骨膜胶原纤维沉积情况。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行t检验，Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 骨标志物水平比较

与对照组相比，假手术组没有出现明显改变。去势6 w和15 w组骨β-胶原降解产物水平明显升高，骨密度值明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病15 w松质骨β-胶原降解产物水平明显升高，骨密度值明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病合并去势组6 w和 15 w组松质骨β-胶原降解产物水平明显升高，骨密度值明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)(图1、2)。

图1 各组β-胶原降解产物水平比较(P<0.01)Fig.1 Comparison of the levels of beta collagen degradation products among each group(P<0.01)

图2 各组骨密度值比较(P<0.01)Fig.2 Comparison of bone mineral density among each group (P<0.01)

2.2 各组骨组织形态学比较

图3 各组股骨骨松质光镜下的结构特点(HE法，标尺示20 μm)。A：6 w组各组股骨骨松质光镜下结构特点(A1：对照组，A2：假手术组，A3：去势组，A4：糖尿病组，A5：糖尿病合并去势组)；B：15 w组各组股骨骨松质光镜下结构特点(B1：对照组，B2：假手术组，B3：去势组，B4：糖尿病组，B5：糖尿病合并去势组)Fig.3 The structural characteristics of the cancellous bone in femurs under light microscope (HE method, ruler 20 μm). A: in 6 w groups (A1: control group, A2: sham operation group, A3: ovariectomized group, A4: diabetes group, A5: diabetes mellitus and castration group); B: in 15 w groups (B1: control group, B2: the sham operation group, B3: ovariectomized group, B4: diabetes group, B5: diabetes mellitus and castration group).

对照组股骨的骨小梁粗大(图3A1)。假手术6 w组骨小梁粗大稍厚，未见吸收或断裂现象(图3A2)。去势6 w组骨小梁变细变薄，骨髓腔变大(图3A3)。糖尿病6 w组骨小梁尚未见大片成块状缺失(图3A4)。糖尿病合并去势6 w组(图3A5)。对照组15 w组股骨的骨小梁依然粗大厚实(图3B1)。假手术15 w组股骨的骨小梁较多较厚，未见骨小梁断裂(图3B2)。去势15 w组骨小梁排列稀疏变薄，不规则弯曲、间距增大，结构紊乱(图3B3)。糖尿病15 w组骨小梁排列稀疏、出现编织状纤维骨组织，部分骨小梁断裂(图3B4)。糖尿病合并去势15 w组骨小梁稀疏变薄断裂。出现编织状纤维骨组织，骨髓腔普遍增大，腔内造血组织明显减少(图3B5)。

2.3 组织计量学指标测定统计学结果

与对照组相比，假手术组没有出现明显改变。去势6 w和15 w组骨小梁间距明显升高，骨小梁厚度明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病15 w骨小梁间距明显升高，骨小梁厚度明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病合并去势组6 w和15 w组松质骨骨小梁间距明显升高，骨小梁厚度明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)(图4、5)。

图4 各组骨小梁厚度比较(P<0.01)Fig.4 Comparison of trabecular thickness among each group(P<0.01)

2.4 骨膜胶原代谢的改变

Van Gieson氏染色结果，对照6 w组骨基质胶原纤维积聚有序(图6A1)。假手术6 w组骨基质胶原纤维积聚、紧密排列，方向有序(图6A2)。去势6 w组骨基质胶原纤维染色较深(图6A3)。糖尿病6 w组骨基质胶原纤维较多，但松散(图6A4)。糖尿病合并去势6 w组骨基质胶原纤维染色浅，排列稀疏(图6A5)。对照15 w组胶原纤维紧密排列(图6B1)。假手术15 w组骨基质胶原纤维染色深，紧致有序(图6B2)。去势15 w组骨基质胶原纤维松散无序分布(图6B3)。糖尿病15 w组骨基质胶原纤维染色浅，排列稀疏(图6B4)。糖尿病合并去势15 w组胶原纤维稀疏，明显减少(图6B5)。

图6 各组股骨骨松质胶原纤维分布特点(Van Gieson法，标尺示20 μm)。A：6 w组各组股骨骨松质胶原纤维分布特点(A1：对照组，A2：假手术组，A3：去势组，A4：糖尿病组，A5：糖尿病合并去势组)；B：15 w组各组股骨骨松质胶原纤维分布特点(B1：对照组，B2：假手术组，B3：去势组，B4：糖尿病组，B5：糖尿病合并去势组)Fig.6 Femoral bone collagen fiber distribution characteristics of loose matter (Van Gieson method, ruler 20 μm). A: distribution characteristics of collagen fiber in the femoral bone in 6 w (A1: control group, A2: sham operation group, A3: ovariectomized group, A4: diabetes group, A5: diabetes mellitus and castration group); B: distribution characteristics of collagen fiber in the femoral bone in 15 w (B1: control group, B2: sham operation group, B3: ovariectomized group, B4: diabetes group, B5: diabetes mellitus and castration group).

图5 各组骨小梁间距比较(P<0.01)Fig.5 Comparison of trabecular separation among each group(P<0.01)

2.5 骨膜胶原面密度积分统计学结果

与对照组相比，假手术组没有出现明显改变。去势15 w组、糖尿病15 w组、糖尿病合并去势组6 w和15 w组胶原面密度积分明显明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)(图7)。

图7 各组胶原纤维含量比较(P<0.01)Fig.7 Comparison of levels of collagen fibers among each group(P<0.01)

3 讨论

本研究采用复合造模法，建立绝经期糖尿病骨质疏松症大鼠模型[4]。雌激素受体是成骨细胞主要受体，通过与雌激素的结合可以增加成骨细胞的活性，促进新生骨的形成。绝经期后内源性雌激素分泌下降[5]，对成骨细胞的作用减低，会加速人体内骨质的丢失，与OP有着密切联系[6-7]。在正常骨代谢中，骨骼重建是在破骨细胞和成骨细胞作用下有序进行的。本文研究结果提示，绝经后OP妇女存在明显的骨代谢异常。Ⅰ型胶原蛋白与骨结合蛋白是骨骼组成的主要成分，而Ⅰ型胶原占骨胶原的97%以上，提供矿化的骨架。β-胶原降解产物是Ⅰ型胶原蛋白的降解产物，通过检测β-胶原降解产物可了解到患者破骨细胞活性。由于OP患者骨吸收增强，使得β-胶原降解产物释放更多。从而间接了解骨转换程度，绝经后OP妇女体内破骨细胞的活性增强，且骨吸收速度远远超过了骨形成速度。临床诊断OP的金标准为骨密度值。雌激素和骨标志物与绝经后妇女OP的关系密切[7]。另一方面，内源性雌激素的减少对下丘脑-垂体的负反馈调节能力下降，垂体分泌的卵泡刺激素大量增加，导致破骨细胞数量和活性增强，骨质流失进一步加快[8]。

另外，高血糖的毒性逐渐造成各种代谢紊乱，引起晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products，AGEs)的蓄积，直接影响成骨细胞的增殖，在一定程度上影响了骨胶原蛋白的形成，Ⅰ型胶原合成减少[9]。糖尿病患者由于胰岛素分泌相对或绝对不足，抑制了成骨细胞的活性，骨形成降低。绝经后糖尿病患者出现骨代谢的影响因素较多，如雌激素、血清抗酒石酸酸性磷酸酶等[10]。高血糖致渗透性利尿，促使钙、磷排出增加，血钙浓度降低，刺激甲状旁腺激素分泌，溶骨作用增强，骨吸收增加，骨矿化减少而致骨密度下降[11]。长期高血糖状态导致糖尿病患者体内HbA1c蓄积，直接或间接影响骨蛋白及骨细胞分化，骨形成减少，骨脆性增加[12]。糖尿病导致微血管病变会降低骨血流量，骨脆性增加、骨量流失[13]。高糖环境的毒性作用，特别是对成骨细胞合成能力的抑制并促进骨吸收[14]。

大量动物实验和临床观察发现雌性动物的糖尿病发病率远不及雄性，而去势后雌性动物糖尿病发病率升高。雌激素调节胰岛素受体的基因表达，雌激素还能通过雌激素受体ERa起到一定的抗P细胞调亡作用，从而保护胰岛功能[15]。研究结果证实雌激素与糖代谢并不是两个独立的个体，糖尿病的发生发展与更年期女性内源性雌激素水平的变化具有相关性。研究提示绝经和血糖量均与骨质疏松的形成发展密切相关[16]，其中时间、病程及交互有待进一步研究，为临床预防和治疗提供合理的指导。