补肾中药通过调控Notch1蛋白的表达治疗大鼠骨质疏松性骨折的作用研究

李永贤 张顺聪 梁德 郭丹青 莫国业 李大星 郭惠智 冯蓬勃 李永巍莫凌 杨志东 唐永超

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405 2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510407 3.广州中医药大学中医骨伤科学国家重点学科实验室，广东 广州 510405

骨质疏松症(osteoporosis，OP)影响全世界大多数女性人口，已被WHO列为十大最严重疾病之一[1]。骨质疏松性骨折是骨质疏松症最常见的并发症之一[2]，增加老年患者的致残率和死亡风险[1]，并且为经济带来极大负担[3]。因此，深入研究骨质疏松性骨折骨重建的发生机制和防治措施，对提高患者的生存质量和降低死亡率具有重要意义。骨质疏松性骨折发生的主要机理在于成骨细胞的骨形成功能和破骨细胞的骨吸收功能间的失平衡，导致骨量减少、结构退化、骨脆性增加，当载荷超过其自身的支持强度时引起骨折[4]。骨折后骨重建的核心是成骨细胞骨吸收和破骨细胞骨生成反应间的相互耦联的过程，是一动态连续的过程[5]，而成骨细胞的活化引起骨吸收是骨重建的起始阶段，对于骨重建具有不可替代的作用。因此，研究关于调控成骨细胞活化或调亡的机制是防治骨质疏松的重要策略。

近年发现，Notch信号通路调控破骨细胞的分化及功能，并对骨细胞存活及骨重建起关键作用[6]。但目前关于Notch信号通路调节骨重建的研究较少，骨质疏松性骨折患者的骨重建机制仍不清楚。因此，阐明Notch信号通路与调控成、破骨细胞分化的具体机制，对于防治骨质疏松相关疾病具有重大意义。骨质疏松性椎体骨折属祖国医学“骨萎骨折”的范畴，在对其认识和治疗上积累了丰富的经验，现代研究发现补肾活血法可使减少破骨细胞形成，增加成骨细胞生成，来防治骨质疏松相关疾病。最近研究发现Notch信号通路调节对骨细胞活性及骨重建方面起着关键作用，但补肾法是否通过影响Notch信号通路相关因子而调节骨重建尚不清楚。因此，本研究一方面进一步探讨Notch信号通路调节成骨、破骨细胞的分化及功能的机制；另一方面，深入研究补肾中药治疗骨质疏松性骨折的作用机理，为以后临床治疗骨质疏松性骨折提供理论基础和治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 补肾中药配制

补肾中药选取右归丸加减方，由附子、肉桂、鹿角胶、熟地黄、枸杞子、山茱萸、山药、菟丝子、杜仲、牛膝、当归、桃仁、红花组成，90 ℃煎煮至上清液浓缩为2∶1。冷却后，滤纸过滤，4 ℃冷藏静置48 h，离心后取上清液，放入4 ℃冰箱保存备用。灌胃前用蒸馏水配制成10、20、40 mg/mL浓度待用。

1.2 实验试剂

生理盐水购于华南医药公司，补肾中药、抗生素购于广州中医药大学第一附属医院，其余试剂均购于广州菲博生物科技公司。

1.3 实验动物分组与处理

60只SPF级12月龄雌性SD大鼠，(400±20)g，由广州中医药大学动物实验中心提供，饲养于广州中医药大学SPF级动物实验中心室内。随机平均分为5组，分别为正常组、骨质疏松骨折模型组、高、中、低剂量补肾中药治疗组，各组均摘除卵巢，术后3个月形成骨质疏松模型。随后除正常组外，其余各组在无菌条件下用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，取仰卧位，四肢用橡皮筋固定，去毛后酒精消毒右后肢，铺巾。做左侧膝关节内侧切口，切开皮肤，皮下组织及肌肉，显露股骨及髌韧带，沿髌韧带内侧打开关节腔，用1.0 mm的克氏针于股骨平台偏前方沿股骨长轴旋入约14～17 mm长度，然后以文氏钳继续将克氏针顶入，确保克氏针牢固固定于远端髓内松质骨中。牵拉推移皮肤使股骨中段暴露切口内，用小型电钻锯断股骨，用生理盐水冲洗创面后，以4-0号丝线缝合切开的肌肉、关节囊、皮下组织及皮肤，建立起股骨骨折模型。骨松骨折模型成立后，对每只大鼠腹腔注射80万 U/kg青霉素钠盐进行抗感染治疗，通过双能X射线观察骨折情况(图1)，每日给予正常组与模型组生理盐水进行灌胃，治疗组分别给予高、中、低剂量补肾中药灌胃12 w进行治疗。

图1 大鼠股骨骨松骨折模型X光片Fig.1 X-ray photo of osteoporotic fractured femur in the rat

图2 补肾中药对血清中碱性磷酸酶、TRAP和骨钙素含量的影响。A：碱性磷酸酶；B：TRAP破骨标志物；C：骨钙素注：NC：正常组；MC：骨质疏松骨折模型组；BS-L/M/H：补肾中药低、中、高剂量治疗组。Fig.2 Influence of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine in serum alkaline phosphatase (AKP), strACP (TRAP), and osteocalcin (OC). A: AKP; B: TRAP; C: OC.Note: NC, normal control group; MC, osteoporotic fracture model group; BS-L/M/H, low/middle/high dose of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine-treated group.

1.4 指标检测

末次实验结束后对大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，应用双能X射线检测大鼠股骨的骨密度。使用普通采血管和采血针，通过腹主动脉采取血液，静置1～2 h后在4 ℃下冷冻离心，3 000 r/min，离心10 min，分离上清液得到血清样品，通过ELISA法测量碱性磷酸酶、骨钙素、血清抗酒石酸性磷酸酶(serumtar trate-resistantacid phosphatase，strACP)破骨标志等指标含量，对股骨样品进行甲醛浸泡24 h、脱钙3～4 w后制作HE染色切片进行病理学检查以及Western blot法检测Notch1蛋白的表达情况。

1.5 统计学方法

2 实验结果

2.1 补肾中药对血清中碱性磷酸酶、TRAP和骨钙素含量的影响

ELISA法测定大鼠血清中碱性磷酸酶、TRAP和骨钙素含量的结果如图2所示。结果显示，骨质疏松骨折模型组与正常组相比，碱性磷酸酶与TRAP的含量显著升高，骨钙素含量明显下降，差异均具有统计学意义(P<0.01)。而经过补肾中药治疗后，治疗组中的碱性磷酸酶与TRAP的含量显著降低，骨钙素含量明显提升，上述指标在高剂量治疗组中与模型组相比差异均具有统计学意义(P<0.01)，呈明显的剂量依赖性。

2.2 补肾中药对骨组织中Notch1蛋白表达的影响

Western blot实验的免疫印迹条带和光密度值如图3所示。结果显示，Notch1蛋白的表达在模型组中受到显著抑制(与正常组相比，P<0.01)，而补肾中药具有调节Notch1蛋白表达的作用，且成明显剂量相关性，3个剂量治疗组的Notch1蛋白表达与模型组相比显著升高(P<0.01)，且高剂量治疗组的表达水平与正常组接近。上述结果提示补肾中药具有调节Notch1蛋白表达的作用。

图3 补肾中药对骨组织中Notch1蛋白表达的影响。A：免疫印迹条带；B：光密度值注：NC：正常组；MC：骨松骨折模型组；BS-L/M/H：补肾中药低、中、高剂量治疗组。Fig.3 Influence of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicines in Notch1 protein in bone. A: Lanes of Notch1 protein; B: Quantitative results of different groupsNote: NC, normal control group; MC, osteoporotic fracture model group; BS-L/M/H, low/middle/high dose of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine-treated group.

图4 各组大鼠股骨骨折端病理学染色切片(200×)Fig.4 Histological examination on rat fractured femurs with H&E staining in different groups (200×)

2.3 补肾中药对骨密度的影响

病理组织学切片结果如图4所示，骨质疏松骨折模型组与正常组相比，在骨折端的成骨细胞数量较少，破骨细胞数量较多，而高剂量补肾中药治疗组在骨折端的成骨细胞数量较多，破骨细胞数量较少。X光片骨密度值测量结果显示(图5)，模型组的骨密度与正常组相比显著下降(P<0.01)，经补肾中药治疗后，骨密度显著回升，高剂量治疗组的骨密度与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。上述结果提示，补肾中药具有提高骨密度的效果。

3 讨论

骨质疏松性骨折发生的主要机理在于成骨细胞的骨形成功能和破骨细胞的骨吸收功能间的失衡，导致骨量减少、结构退化、骨脆性增加，当载荷超过其自身的支持强度时引起骨折。骨质疏松性骨折的根本原因在于骨质疏松，因此积极地治疗骨质疏松是防治OVCF骨质疏松性骨折的前提条件，古人对骨质疏松症的根本病机认识主要为肾精不足所致。《内经》曰“气伤形，形伤肿”，宋《圣济总录》也指出“筋、肉、骨、节误致所折，则气血癖滞疼痛”，认为骨折损伤气血，致血脉离经去行，恶血留滞，形成血瘀，以致气血运行失常、癖积不散为肿为痛。清·陈士铎在《辨证录》中也指出“血不活则癖不能去，癖不去则骨不能接”。基于这些观点，认为骨质疏松性骨折的基本病机为肾虚所致，采用补肾法治疗取得了较好的疗效[7-8]，为防治骨质疏松性骨折提供了新的思路和方法，是当前研究的热点。

图5 各组大鼠股骨骨密度值注：NC：正常组；MC：骨松骨折模型组；BS-L/M/H：补肾中药低、中、高剂量治疗组。Fig.5 BMD of the rat femur in different groupsNote: NC, normal control group; MC, osteoporotic fracture model group; BS-L/M/H, low/middle/high dose of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine-treated group.

Notch信号通路为一广泛应用且高度保守的信号转导途径，是影响细胞命运决定的重要通路之一，相邻细胞之间通过Notch受体或配体传导信号，调节包括干细胞在内的多种细胞的分化、增殖和调亡[9]。最近研究表明，Notch信号通路参与OPG/RANKL/RANK系统调控破骨细胞的分化及功能，并对骨细胞存活及骨重建起关键作用[6]。

Notch信号转导通路由Notch受体、Notch配体和CSL DNA结合蛋白3部分组成。哺乳动物有4种Notch受体(Notch1、 Notch2、 Notch3、 Notch4)和5种Notch配体(Jagged1、Jagged2、 Delta1、 Delta3、Delta4)，广泛分布于造血干细胞、胚胎干细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞等多种细胞表面，Notch信号由两个邻近细胞的Notch受体与配体相互作用而激活Notch。配体与受体结合后，在ADAMI0/KUZ或ADAM17/TACE作用下，Notch受体于细胞膜外被酶切，释放出和Notch配体连接的胞外部分，随后在γ-分泌酶的作用下，胞内段被酶切，形成可溶性的NICD(notch intracellular domain)转移至核内，通过激活转录因子SCL而调节基因表达[9]，Notch的下游靶基因主要以HES家族成员为主，包括HESl、HES5、 HEY1等。

目前关于Notch信号通路调节破骨细胞分化及功能影响骨重建相关研究较少。Yamada等[6]发现Notch1转染的间充质细胞表现出RANKL及OPG基因的表达增加，而巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达的强烈抑制，导致破骨细胞分化能力减弱。这些发现表明Notch信号通路同时影响破骨前体细胞和间充质细胞，并对破骨细胞生成产生负向调节作用[10]。有学者发现，人体外敲除骨基质巨噬细胞中的Notch1、Notch2、Notch3，可以促进破骨细胞前体的增殖与分化[11]；破骨细胞中的Notch1失活会抑制其OPG的表达，进而促进破骨细胞的分化与骨吸收能力，从而证明Notch信号转导通路对破骨细胞具有抑制作用[12]。Duan等[13]指出NF-kB的活性在RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收中增加。RAW264.7细胞中的HES1的mRNA和蛋白表达在RANKL刺激后增加。因此认为，在RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收介导的NF-kB信号通路中，Notch信号被激活。在成骨细胞对破骨细胞调节作用方面，Notch信号转导通路通过促进成骨细胞OPG的表达，从而减弱RANK通路介导的破骨细胞分化作用。Bai等[12]研究还表明破骨细胞上表达有Notch配体(Delta1、 Jagged1和Jagged2)，将成骨细胞上的Notch1敲除后，由于OPG表达的降低可引起破骨细胞数量的增加。而Notch 信号转导通路调节失调可以导致骨发育失调等疾病[10，13]。近年来通过Notch信号转导通路调节OPG/RANKL/RANK系统对骨重建的研究主要局限于动物研究，少于与骨质疏松患者相连，骨质疏松性椎体骨折患者骨重建的机制仍不清楚[14]。因此，阐明Notch信号通路与OPG/RANKL/RANK系统相互作用调控破骨细胞分化影响骨重建的具体机制，寻找靶向调控OPG、RANKL表达的Notch信号通路相关配体或受体，对于防治骨质疏松相关疾病具有重大意义。

本研究发现，骨质疏松骨折模型组与正常组相比，在骨折端的成骨细胞数量较少，破骨细胞数量较多。运用补肾中药治疗骨质疏松骨折大鼠后，高剂量治疗组在骨折端的成骨细胞数量较多，破骨细胞数量较少，提示补肾中药具有促进骨性愈合的效果。另外，模型组的骨密度与正常组相比显著下降(P<0.01)，经补肾中药治疗后，骨密度显著回升，高剂量治疗组的骨密度与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。研究发现，骨质疏松骨折模型组与正常组相比，碱性磷酸酶与TRAP的含量显著升高，骨钙素含量明显下降，差异均具有统计学意义(P<0.01)。而经过补肾中药治疗后，治疗组中的碱性磷酸酶与TRAP的含量显著降低，骨钙素含量明显提升，上述指标在高剂量治疗组中与模型组相比差异均具有统计学意义(P<0.01)，呈明显的剂量依赖性。另外，Western blot结果也显示，Notch1蛋白的表达在模型组中受到显著抑制(与正常组相比，P<0.01)，而补肾中药具有调节Notch1蛋白表达的作用，且成明显剂量相关性，3个剂量治疗组的Notch1蛋白表达与模型组相比显著升高(P<0.01)，且高剂量治疗组的表达水平与正常组接近。本研究结果提示，补肾中药能够通过调节Notch1蛋白的表达来抑制血清中破骨标志物碱性磷酸酶和TRAP的水平，并提高骨钙素的含量来刺激成骨细胞生成、抑制破骨细胞分化，从而加速骨折的愈合，提高骨密度，对大鼠股骨骨质疏松骨折具有良好的治疗作用。