hsa-miR-655靶向CLCF1基因对人成骨肉瘤MG63细胞 OPG/RANKL系统表达的影响

陈娟 谢丽华 李生强 许惠娟 陈赛楠 叶云金 葛继荣

福建省中医药研究院骨质疏松证候基因组学重点研究室，福建 福州 350003

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，POP)是中老年女性的常见多发病，以骨量低下、骨微结构破坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病，其发生与遗传、内分泌和免疫等因素密切相关[1]。miRNAs是一类内源性、长度约19～26个核苷酸的非编码短小RNA，对骨代谢和骨的发育重建起着重要作用[2]。课题组前期研究发现，hsa-miR-655通过靶向结合CLCF1 mRNA的3'UTR区，在转录后水平负性调控绝经后骨质疏松症关联基因CLCF1的表达[3]，但hsa-miR-655介导CLCF1基因参与POP的具体机制尚不清楚。

CLCF1是B淋巴细胞的催化剂，可刺激B细胞活化，参与体液免疫[4]。“骨免疫学”理论认为，骨骼系统与免疫系统之间存在密切关系，免疫失调可导致骨代谢异常[5]。OPG/RANKL/RANK 系统作为连接骨代谢与免疫系统之间的桥梁，是调节骨重建的一类重要的信号通路。本研究通过在人成骨肉瘤MG63细胞系中过表达hsa-miR-655，研究hsa-miR-655通过靶向调控CLCF1基因表达，对细胞增殖和骨免疫重要通路OPG/RANKL/RANK系统的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人成骨肉瘤细胞 MG63(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；MEM培养基(GIBCO公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，GIBCO公司)；青链霉素(Invitrogen公司)；hsa-miR-655表达慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司，货号MI0003677)；hsa-miR-655引物、U6引物(广州市锐博生物科技有限公司)；microRNA提取试剂盒(Qiagen公司)；miRNA反转录试剂盒、miRNA定量试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)；Trizol试剂(Invitrogen公司)；PrimeScript 逆转录试剂盒(Fermentas公司)；CLCF1、OPG、RANKL引物(宝生物工程有限公司)；CLCF1、OPG、RANKL、GAPDH抗体(Abcam公司)；Cell Counting Kit-8试剂盒(日本同仁公司)；SYBR©PremixExTaqTMGC Kit(TaKaRa公司)；PCR仪(ABI 7500 Fast)；核酸检测仪(NanoDrop 2000/2000c 分光光度计，Thermo公司)；Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡盒、细胞周期检测试剂盒(BD公司)；FACS Calibur流式细胞仪(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1MG63细胞培养和慢病毒感染：MG63细胞用MEM培养基，含10%FBS、1%双抗，置于5% CO2孵箱中37 ℃恒温培养箱培养。转染前先将MG63细胞接种于6孔板中，分2组：阴性对照组(NC组)和hsa-miR-655过表达组(OE组)。OE组和Vector组按照感染复数50(multiplicity of infection，MOI)，分别感染hsa-miR-655表达慢病毒及相应阴性对照慢病毒。24 h后换正常培养液，转染72 h后荧光显微镜及流式细胞术(flow cytometry，FCM)观察感染效率，并收取细胞进行相关检测。

1.2.2实时荧光定量PCR：根据试剂盒说明分别提取细胞microRNA和总RNA。定量后利用逆转录试剂盒进行逆转录获得定量 PCR模板。引物序列见表1，荧光定量PCR反应条件如下：①预变性：95 ℃ 10 s，②变性：95 ℃ 5 s，③退火、延伸：60 ℃ 31 s，40个循环。每组均做3个重复，取均数。miR-655相对定量计算以U6作为内参，CLCF1、OPG、RANKL相对定量计算以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.2.3细胞增殖实验：收集各组MG63细胞，以2×103/孔的细胞数接种于96孔板，各实验组均设3个复孔，每孔添加培养液100 μL。分别于0、24、48、72、96 h行CCK8检测。每孔加入CCK8试剂10 μL，避光孵育3 h。酶标仪检测450 nm 处各孔的吸光度值(OD450)，用空白对照调零去除背景值。

1.2.4流式细胞术分析细胞周期分布：收集各组细胞，将约1×106个细胞移入离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清，PBS溶液清洗一次。加入70%冰乙醇5 mL混匀固定，4 ℃放置48 h以上。检测前加入0.5 mLPI/RNase(BD公司，货号550825)染色液，室温避光染色15 min，流式细胞仪检测细胞周期时相。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5Western blot 检测蛋白水平：RIPA 裂解法提取转染后各组MG63细胞总蛋白，定量蛋白浓度。40μg蛋白样品，SDS-PAGE胶分离蛋白。采用湿转系统，100 V恒压转膜60 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；分别加入CLCF1抗体(1∶1000)、OPG抗体(1∶1000)、RANKL抗体(1∶500)和GAPDH抗体(1∶2000)。4 ℃孵育过夜；1×TBST 漂洗3次，加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗(1∶4000)，常温孵育1 h；1×TBST 漂洗4次，避光条件下化学发光检测，并进行灰度值分析。以GAPDH作为内参计算目的蛋白相对灰度比值。

2 结果

2.1 hsa-miR-655过表达后上调MG63细胞miR-655水平

慢病毒感染MG63细胞，72 h后荧光显微镜和流式细胞术观察细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表达情况，结果显示，MOI=50时，感染效率为80%以上(图1A、1B)。qRT-PCR检测hsa-miR-655在MG63细胞中的相对表达水平，与对照组相比，过表达组hsa-miR-655表达水平显著升高，差异有统计学意义(P=0.0004，图1C)，提示成功建立hsa-miR-655过表达的MG63细胞株。

图1 hsa-miR-655过表达后MG63细胞miR-655水平的检测。A：荧光显微镜观察GFP阳性MG63细胞；B：流式细胞术检测细胞GFP阳性率；C：qRT-PCR 检测hsa-miR-655表达水平Fig.1 Expression of hsa-miR-655 in MG63 cells. A: GFP positive MG63 cells were observed with fluorescence microscopy; B: GFP positive rate was detected with flow cytometry; C: qRT-PCR was used to detect hsa-miR-655 expression level.

2.2 hsa-miR-655抑制CLCF1基因的表达

为探讨hsa-miR-655对CLCF1基因的调控作用，笔者分别在mRNA水平和蛋白水平检测CLCF1基因的表达变化。发现与对照组相比，hsa-miR-655过表达组CLCF1蛋白水平明显下调(P=0.0053，图2)，而mRNA水平未见明显变化(P=0.0986，图2)。说明hsa-miR-655在转录后水平抑制CLCF1基因的表达。

2.3 过表达hsa-miR-655抑制MG63细胞增殖

与对照组相比，过表达组MG63细胞增殖能力明显降低，差异具有统计学意义(0 h：P=0.203；24 h：P<0.0001；48 h：P<0.0001；72 h：P<0.0001；96 h：P=0.0005)。说明hsa-miR-655在MG63中有抑制增殖作用，见表2。

表2 CCK8实验检测hsa-miR-655过表达对MG63细胞的增殖调控作用Table 2 Inhibitory effect of hsa-miR-655 on MG63 cell growth detected with CCK8 assay

注：***表示与对照组比较，差别有统计学意义(P<0.001)。

2.4 hsa-miR-655抑制MG63细胞周期的进展

流式细胞术检测周期分布，结果提示，hsa-miR-655过表达组较对照组MG63细胞 G0/G1期细胞比例增加(P=0.0048)，S期细胞比例减少(P=0.0133)，差异具有统计学意义(图3)，由此可见，hsa-miR-655可以使细胞阻滞在G1期，延缓细胞周期进程。

2.5 hsa-miR-655对OPG和RANKL表达的影响

qRT-PCR检测hsa-miR-655过表达后OPG、RANKL mRNA的变化发现，与对照组比较，过表达组OPG(P=0.0384)、RANKL(P=0.0007)mRNA均有所上调，差异具有统计学意义(图4A)；Western blot检测蛋白水平，经图像分析软件计算RANKL和OPG相对灰度比值，结果显示，与对照组比较，过表达组OPG、RANKL蛋白均上调，而OPG/RANKL比值却降低，差异具有统计学意义(图4B，表3)。

3 讨论

miRNA在骨质疏松的发生和进展中发挥了重要的调控功能。课题组前期研究发现hsa-miR-655能靶向调控绝经后骨质疏松症关联基因CLCF1的表达，但hsa-miR-655介导CLCF1基因参与POP的具体机制尚不明确。人成骨肉瘤MG63细胞株具有人成骨细胞表型特征，是最常用的成骨细胞模型之一[6]。本实验在MG63细胞系中过表达hsa-miR-655，观察hsa-miR-655对MG63细胞增殖、细胞周期及CLCF1、OPG和RANKL基因表达的影响。结果显示，过表达 hsa-miR-655显著抑制MG63细胞的增殖，使MG63细胞G1期阻滞，S期比例减少，从而延缓细胞周期进程。同时，过表达miR-655后，CLCF1蛋白水平明显下调，而OPG和RANKL表达水平虽然上调，但OPG/RANKL比值却降低。说明miR-655能通过负调控CLCF1基因的表达，抑制成骨样细胞MG63的增殖，并下调OPG/RANKL的比值。

图2 hsa-miR-655抑制CLCF1基因的表达Fig.2 Up-regulation of hsa-miR-655 inhibited CLCF1 expression

组别OPG(相对灰度值) RANKL(相对灰度值)OPG/RANKL比值NC组121.21±1.52139.92±1.501.63±0.23OE组139.52±4.21**173.45±3.95***0.89±0.12**

注：**表示与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)；***表示与对照组比较差异有统计学意义(P<0.0001)，OPG(P=0.0021)，RANKL(P=0.0002)，OPG/RANKL(P=0.0078)。

图3 FCM测定hsa-miR-655过表达后MG63细胞周期的变化Fig.3 Changes of cell cycle after up-regulation of hsa-miR-655 detected with FCM

图4 hsa-miR-655过表达对OPG、RANKL表达的影响Fig.4 Up-regulation of hsa-miR-655 increased OPG and RANKL expression

作为一类内源性非编码小RNA分子，miRNAs通过对靶基因转录后水平的调控，在骨代谢中具有重要的调控作用。文献报道，miR-26 a在骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)成骨分化过程中表达上调，并通过调控 Wnt信号通路促进 BMSCs的成骨分化[7]。Gao等[8]发现miR-210在人间充质干细胞成骨分化过程表达下调，通过对miR-210的抑制可促进人间充质干细胞成骨分化进程。此外，通过对miRNA表达谱的观察，发现 miR-21在破骨细胞的分化过程中呈高表达，而其高表达可触发级联反应起到促破骨细胞分化的作用，因此miR-21可被认为是早期破骨细胞分化的关键调节miRNA[9]。本研究中的hsa-miR-655基因定位于人14q32.31染色体上，自2005年hsa-miR-655首次被发现以来，越来越多的研究对hsa-miR-655基因及其在各种生物学功能中发挥的作用进行了报道。miR-655在癌症的发生、发展和转移中起重要作用[10-11]。肝癌中miR-655表达较高的患者生存期短于miR-655表达低的。多变量分析显示，miR-655是肝癌的独立危险因素[12]。Kitamura等[13]报道miR-134/487b/655簇能促进TGF-β1诱导的上皮间质转化现象，并通过直接靶向MAGI2来影响肺癌细胞的耐药性。笔者前期研究发现，hsa-miR-655 可以靶向结合CLCF1 mRNA的3'UTR区，在转录后水平调控CLCF1基因表达。本研究结果进一步证实了miR-655能抑制CLCF1的表达，并对人成骨样细胞MG63的增殖起调控作用。

CLCF1是B淋巴细胞的催化剂，可通过gp130受体刺激B细胞活化，参与体液免疫。CLCF1属白细胞介素6(IL-6)细胞因子家族成员，IL-6是骨吸收的主要调节者，其主要通过激活 JAK2/STAT3 信号通路发挥作用[14]。研究表明IL-6 与成骨细胞、基质细胞、破骨细胞及其前体产生密切相关，能促进骨及骨髓中破骨细胞增加。文献报道[15]JAK2/STAT3是破骨细胞前体细胞分化成熟过程中的关键信号通路，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)竞争性JAK2激酶抑制剂AG490通过下调STAT3(Ser727)磷酸化水平，抑制核因子kB受体活化因子配体诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞的分化。课题组前期研究发现，CLCF1在绝经后骨质疏松症中表达下调，且CLCF1基因过表达后可以激活JAK2/STAT3信号通路[16]。结合本实验结果，hsa-miR-655通过靶向调控CLCF1基因的表达，下调OPG/RANKL的比值。因此，笔者推测hsa-miR-655对OPG/RANKL的影响可能与JAK2/STAT3信号通路有关。

“骨免疫学”理论认为，骨骼系统与免疫系统之间存在密切关系，免疫失调可导致骨代谢异常。OPG/RANKL/RANK系统则是骨代谢与免疫系统之间的桥梁，OPG、RANKL和其唯一受体RANK形成了一个调节破骨细胞的信号系统，并且是影响破骨细胞分化、发育和功能的最终途径，在骨质疏松中起重要作用[17]。成骨细胞分泌RANKL，RANKL可激活破骨细胞和破骨细胞前体细胞膜表面RANK受体，引起破骨细胞的形成和活化。OPG/RANKL比例的变化对于维持成骨细胞与破骨细胞之间的平衡很重要[18]。研究表明，IL-6 可以通过各种因素对成骨细胞和破骨细胞之间的OPG/RANKL/RANK 信号通路产生影响[19-20]。IL-6 通过诱导成骨细胞上RANKL 表达，与前破骨细胞上所表达的 RANK 相互作用，经 RANK 信号通路促进破骨细胞分化。研究发现，hsa-miR-655过表达后，OPG和RANKL表达均上调，但OPG/RANKL的比值却下调。推测hsa-miR-655可能通过CLCF1调控成骨细胞OPG/RANKL系统，进而影响成骨细胞与破骨细胞之间的平衡。而OPG水平的增加可能是由于 RANKL和OPG都在成骨细胞中分泌，RANKL水平增加，OPG的水平进而代偿性地提高所导致。

综上所述，hsa-miR-655可以通过负调控CLCF1基因，抑制成骨样细胞MG63的增殖和细胞周期进展，促进RANKL、OPG表达并下调OPG/RANKL的比值。但对hsa-miR-655促进RANKL、OPG表达增加的分子机制仍待后续进一步研究。