护骨胶囊对去卵巢大鼠钙相关激素和性腺激素影响的研究

林泽苗 钟佳贤 贾欢欢 吴玉娥 陈珺 曹祺 曹克广 李青南，*

1. 广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006 2. 广东省实验动物重点实验室，广东省实验动物监测所，广东 广州 510663

绝经后骨质疏松症是由于卵巢功能衰退，血内雌激素水平下降，致使骨吸收与骨形成加速，从而造成高转换型骨量丢失，结果导致骨小梁断裂、穿孔，皮质骨变薄，易于发生骨折的一种疾病[1-2]。去卵巢大鼠的雌激素水平下降，与人类绝经后的骨质疏松相似。

中药复方护骨胶囊为广东安诺药业股份有限公司的产品，由制何首乌、淫羊藿、熟地黄、龟甲、骨碎补、杜仲、续断、巴戟天、当归和山药等中药根据中医的君臣佐使原则组成。目前在临床已广泛应用于治疗原发性骨质疏松症。为深入探讨其作用机理，本实验采用护骨胶囊作用于去卵巢大鼠，观察大鼠血清中与钙代谢直接相关的激素和性激素及子宫的影响，以进一步阐明其预防骨质疏松症的作用机理。

1 材料和方法

1.1 实验动物与实验环境

3月龄SPF级雌性 SD大鼠60只，体重(210±3)g (由广东省医学实验动物中心提供，实验动物许可证号：NO.44007200017783)。饲养于广东省实验动物监测所，室温为(25±2)℃，湿度为(60±2)%。任意进食大鼠标准饲料和饮水。

1.2 动物分组与造模

按随机函数将大鼠分为6组：假手术组(Sham)；去卵巢组(OVX)；仙灵骨葆胶囊组(Pos)；护骨胶囊低剂量组(HG-L)；护骨胶囊中剂量组(HG-M)；护骨胶囊高剂量组(HG-H)。每组各10只。适应性喂养2w后,用2%戊巴比妥钠，按45mg/kg 腹腔注射对大鼠进行麻醉，大鼠成功麻醉后，行双侧卵巢切除手术。假手术组按同法操作，仅摘除双侧卵巢周围部分脂肪。

1.3 药物及给药方法

护骨胶囊由制何首乌、淫羊藿、熟地黄、龟甲、巴戟天、杜仲、续断、骨碎补、当归和山药组成，由广东安诺药业股份有限公司生产，批准文号为药准字Z20040124，批号为20150101，规格为0.45 g；仙灵骨葆胶囊(阳性药物)由淫羊藿、续断、补骨脂、知母、丹参和地黄组成，由贵州同济堂制药有限公司生产，批准文号为国药准字Z20025337，批号为20140701，规格为0.50 g。仙灵骨葆胶囊组每天灌服人体等效剂量的仙灵骨葆胶囊0.270 g/(kg·10ml)。护骨胶囊低、中、高剂量组每天分别灌服0.243 g/(kg·10ml)、0.486 g/(kg·10ml)、0.972 g/(kg·10ml)。其中护骨胶囊中剂量组为人体等效剂量组。

1.4 主要试剂及仪器

试剂：石蜡、二甲苯、无水乙醇、盐酸乙醇、TO生物型制片透明剂、苏木精液、伊红液、中性树胶。仪器：Leica包埋机、Leica切片机、Leica碳化钨钢刀、Leica生物显微镜。

1.5 血清性激素的检测

药物干预结束时，心脏取血处死大鼠，将血液以3000 r/min离心20 min，分离出血清，送至上海邦奕生物科技有限公司，采用Elisa试剂盒检测血清激素5项：1, 25双羟维生素D3(1,25(OH)2D3)、甲状旁腺激素(PTH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睾酮(T)。

1.6 子宫观察

药物干预结束时，心脏取血处死大鼠，取各组大鼠子宫，称重后，进行石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察。

1.7 数据处理

2 结果

2.1 OVX及HG对大鼠血清PTH和1,25(OH)2D3的影响

与Sham组比较，OVX组的PTH水平显著升高(P<0.01)；与OVX组相比，PTH水平在HG-L、HG-M(P<0.01)和HG-H组(P<0.05)减少，HG-H组比HG-L、HG-M组显著升高，Pos组与OVX组比差异无统计学意义(P>0.05)。HG各组均比Pos组降低(P<0.01、P<0.05)。1,25(OH)2D3在此实验中差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠实验后血清激素指标的变化±s，ng/L)Table 1 Changes of serum hormone indexes in rats after ±s，ng/L)

Note:*,**P<0.05,0.01 VS Sham;#,##P<0.05 VS OVX;△，△△P<0.05,0.01 VS Pos;□，□□P<0.05,0.01 VS HG-L;◇，◇◇P<0.05,0.01 VS HG-M.

2.2 OVX及HG对大鼠血清E2、P和T的影响

与Sham组相比，OVX组的E2水平和P水平下降(P<0.01，P<0.05)，T水平升高(P<0.05)。与OVX组相比，E2水平在HG-L和HG-M组增加(P<0.01)，HG-H组无统计学意义，但HG-H组较HG-L、HG-M组下降(P<0.05)。Pos组与OVX组比较差异无统计学意义。HG-L和HG-M组的E2较Pos显著升高；P水平在Pos组显著性升高(P<0.01)，在HG-L组减少(P<0.05)，HG-M组和HG-H组无变化。T水平在HG-L组和HG-H组无变化，HG-M组减少(P<0.01)，在Pos组显著性升高(P<0.01)。见表2。

2.3 OVX及HG对大鼠子宫的影响

Sham组、OVX组、Pos组、HG-L组、HG-M组、HG-H组的子宫重量分别是(0.670±0.19)g、(0.103±0.04)g、(0.097±0.02)g、(0.113±0.04)g、(0.112±0.02)g、(0.114±0.06)g。其中，与Sham组比较，各组的子宫重量均显著减少(P<0.01)。药物组的子宫重量与OVX组比无变化。

表2 各组大鼠实验后血清性激素指标的变化±s)Table 2 Changes of serum sex hormone indexes in rats after the experiment(±s)

Note:*,**P<0.05,0.01 VS Sham;#,##P<0.05,0.01 VS OVX;△，△△P<0.05,0.01 VS Pos;□，□□P<0.05,0.01 VS HG-L;◇，◇◇P<0.05,0.01 VS HG-M.

Sham组的子宫内膜上皮细胞肥厚，腔大，无明显增厚及增生；与Sham组比较，OVX组子宫萎缩变小，宫腔变小，子宫内膜上皮细胞萎缩；与OVX组比较，HG-L和HG-M组无明显差异，HG-H组内膜稍增厚。Pos组无明显差异。见图1。

图1 各组大鼠实验后子宫切片(HE染色)。A：假手术组(5×)；B：去卵巢组(5×)；C：仙灵骨葆胶囊组(5×)；D：护骨胶囊低剂量组(5×)；E：护骨胶囊低中量组(5×)；F：护骨胶囊低高量组(5×)Fig.1 The rats uterus slices after the experiment(HE dyeing). A: Sham(5×);B:OVX(5×);C: Pos(5×);D:HG-L(5×);E:HG-M(5×);F:HG-H(5×)

3 讨论

3.1 血清PTH和1,25(OH)2D3分析

PTH和1,25(OH)2D3是调节体内钙、磷系统平衡的两大主要激素[3-4]。本实验OVX组PTH水平升高，可能是因为大鼠去卵巢后，E2水平下降所导致。研究表明[5]，E2分泌下降，会使骨骼中的钙结合力降低，刺激PTH的分泌，PTH激发升高，作用于骨组织，使间质细胞向破骨细胞转化，促进破骨细胞吸收，使骨钙释放入血，导致骨质疏松[6]。而HG各剂量组的PTH水平显著降低，这与补肾化瘀壮骨汤[7]、鹿衔草[8]等对去卵巢大鼠的研究结果一致。提示护骨胶囊能调节去卵巢后的PTH分泌失常。Pos组的PTH水平与OVX组差异无统计学意义，说明仙灵骨葆胶囊不调节PTH，这与赵小梅[9]对仙灵骨葆胶囊的研究一致。而实验各组的1,25(OH)2D3差异均无统计学意义，此结果说明OVX与药物不是通过血清中的1,25(OH)2D3起作用的。

3.2 血清E2、P和T分析

E2主要由卵巢、黄体和胎盘产生，肝、肾上腺皮质及乳房等也能产生少量E2，它是影响雌性动物生殖系统生长发育，维持雌性性机能的重要类固醇激素[10]。当雌激素缺乏时会引起明显的骨量丢失，骨结构退变以及骨高转换等骨质疏松症状[11]。本实验中，OVX组E2水平显著降低，HG-L和HG-M组则显著升高，HG-H组E2水平也升高，但与OVX组比差异无统计学意义。说明护骨胶囊具有补充性激素的作用，能调节去卵巢造成的E2分泌下降，这可能是因为护骨胶囊药物组成里的淫羊藿、制何首乌和骨碎补等补肾中药含有植物雌激素。植物雌激素的研究已越来越受到重视。刘仕杰等[12]发现淫羊藿可提高OVX大鼠血清雌激素水平。杨利娟[13]通过雌激素受体(ERα/β)对靶基因的转录调节作用，证明了何首乌的主要活性成分大黄素、骨碎补中的柚皮苷和淫羊藿中的淫羊藿苷都具有显著的植物雌激素作用，说明护骨胶囊能产生植物雌激素样作用。Pos组的E2水平与OVX组比差异无统计学意义，说明仙灵骨葆胶囊不调节血清E2。这与赵小梅[9]对仙灵骨葆胶囊的研究结果一致。

P是重要的甾体激素，主要在卵巢黄体的颗粒细胞、胎盘的合体滋养层细胞合成[14]。研究发现P能诱导成骨细胞TGF-β1、TGF-β2的表达，促进成骨细胞增殖与分化、增强成骨功能及骨基质合成，促进骨形成[15]。本研究OVX组P水平降低，这与罗晓冰等[16]对OVX大鼠的研究结果一致。服用护骨胶囊后，大鼠血清P水平不升高，这可能是因为E2能与P竞争性激素结合球蛋白上的结合位点，故游离的E2水平升高，P不升高[17]。Pos组P水平显著升高，提示仙灵骨葆胶囊通过P促进成骨的作用。

T具有促进骨形成与钙磷沉积的作用，可直接作用于成骨细胞，还可通过转化为E2间接起作用[18]。P、T和E2均为甾体激素，在体内可以通过中间体雄烯二酮进行P→T→E2的转化[19]。研究发现，绝经后妇女E2主要来自于肾上腺皮质分泌的T在体内的转变[20]。故OVX组T升高，可能是由于去卵巢后E2下降，刺激T分泌。与OVX组比，T水平在HG-L和HG-H组无变化；在HG-M组降低，但与Sham组水平相当，具体原因有待深入研究；仙灵骨葆胶囊的T水平在OVX组的基础上显著升高。有研究表明：T既能增加骨细胞的增生、分化，又能增加碱性磷酸酶的活性而起成骨作用[21]。本研究的结果说明仙灵骨葆胶囊通过T促进成骨的作用。

3.3 OVX及HG对大鼠子宫的影响

大鼠切除卵巢后，子宫明显萎缩。卵巢的功能之一是分泌雌激素，维持子宫功能，雌激素与孕激素等共同作用于子宫内膜[22]。故大鼠切除卵巢后，OVX组E2减少，子宫内膜变薄，子宫萎缩变小，提示造模成功。护骨胶囊能显著增加血清E2水平，但子宫与OVX组比较差异无统计学意义，仅高剂量使子宫内膜稍增加。其原因可能是护骨胶囊含有的成分为植物雌激素，对子宫的影响很小。这与西药雌激素的作用不同，研究发现，长期补充外源性的西药雌激素，易导致子宫内膜增生，水钠潴留，严重的还会出现子宫内膜癌、乳腺癌、血栓栓塞等不良反应[23]。

综上所述，护骨胶囊能降低去卵巢大鼠血清的PTH水平，升高E2水平，说明护骨胶囊能调节与钙代谢直接相关的激素，同时又具有调节和补充雌激素的作用，且对子宫影响不大。该研究提示护骨胶囊对绝经后骨质疏松的治疗机理可能是通过调节血清中的 PTH和E2的水平，为推广护骨胶囊临床防治绝经后骨质疏松提供了实验依据。