畲药嘎狗噜对肢体缺血再灌注损伤模型大鼠凝血功能影响研究

王济纬张宁兰俊许荣成邓连成陈科鄢连和雷后兴

畲药嘎狗噜对肢体缺血再灌注损伤模型大鼠凝血功能影响研究

王济纬1张宁1兰俊1许荣成2邓连成1陈科2鄢连和3雷后兴3

目的观察嘎狗噜水煎液对肢体缺血再灌注损伤模型大鼠凝血功能的影响。方法SD大鼠30只，采用阻断股动脉建立肢体缺血再灌注损伤大鼠模型。随机分为治疗组、假手术组、模型组，各10只，分别以嘎狗噜全草水煎液和等剂量生理盐水灌胃。全自动血凝分析仪检测各组大鼠凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（Fib）、血浆凝血酶时间（TT）；全自动生化分析仪测定血清乳酸脱氢酶（LDH）及肌肝（Cr）等指标。结果与假手术组比较，模型组大鼠PT和APTT显著缩短[（9.03±0.74）s比（9.89±0.72）s，（20.45±1.70）s比（24.24±5.41）s，P＜0.05）]，Fib含量增加[（1.86±0.17）g/L比（1.67±0.22）g/L，P＜0.05]，TT变化不显著（P＞0.05）；LDH、Cr含量显著增高[（791.10±213.6）U/L比（526.50±182.33）U/L，（32.44±6.47）μmol/L比（26.85±4.09）μmol/L，P＜0.01，P＜0.05]。与模型组比较，治疗组大鼠PT[（10.15±0.78）s]和APTT[（25.36±2.08）s]显著延长（P＜0.01），而Fib含量无明显差异（P＞0.05），TT[（20.65±3.03）s比（24.94±2.41）s]显著缩短（P＜0.01）；LDH [（573.90±142.37）U/L]、Cr[（24.34±5.92）μmol/L]含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。结论嘎狗噜能够通过改善凝血/纤溶功能及代谢环境，有效减轻肢体缺血再灌注损伤大鼠的损害程度。

大鼠：缺血再灌注；凝血功能；嘎狗噜

肢体缺血再灌注损伤是临床创伤救治过程中常见的病理过程，组织缺血缺氧性损伤不仅发生在缺血时，更重要的是发生在再灌注后[1]，长时间严重缺血患者血运恢复后肢体及全身组织器官的损伤反而会加重，表现为凝血功能紊乱、组织坏死、细胞凋亡等，严重者甚至危及生命。如何减轻再灌注损伤是创伤临床的一项重要工作。畲药嘎狗噜（地稔）具有清热解毒，活血止血作用[2]，本实验将嘎狗噜应用于实验性肢体缺血再灌注损伤大鼠，探讨有效减少肢体再灌注损伤的方法。

1 实验材料

1.1 实验动物8周龄清洁级健康SD大鼠（体质量200～250g）30只，雌雄不限，温州医科大学实验动物中心提供。许可证号：SYXK（浙）2010-0150。适应性饲养，实验前夜禁食，自由饮水。随机分为治疗组、假手术组、模型组，各10只。

1.2 畲药配置嘎狗噜全草由丽水市畲族医药研究所提供。取嘎狗噜原药材1000g剪碎后分别以10倍量、8倍量、6倍量水煎煮3次，每次30min，合并3次煎煮液滤过、离心，浓缩成1g生药/mL的嘎狗噜浓缩液，置于冰箱冷藏备用。实验用嘎狗噜水煎液由嘎狗噜浓缩液+纯水稀释配制而成，浓度为0.2g/mL。灌胃剂量为1次10mL/kg，1天灌胃1次。

1.3 实验仪器南京SOPTOP舜宇显微镜ST60，上海手术器械厂800型离心机，Beckman Coulter Au 5800型全自动生化分析仪，ACLTOP300CTS全自动血凝分析仪。

2 实验方法

2.1 造模及给药方法大鼠术前12h禁食，自由饮水，术前10%水合氯醛3mL/kg腹腔内注射麻醉。每2h追加一次维持麻醉，剂量减半。麻醉成功后，大鼠仰卧位，四肢固定于木板上，取右腹股沟切口，常规备皮、消毒、铺巾，剪开皮肤，在手术显微镜下显露股动、静脉及股神经，分离出右侧股动脉，予无创动脉夹夹闭，显微镜下确认阻断动脉血流后，缝合切口，再次消毒。同时予以右大腿根部橡皮带环扎，以棉签杆为杠杆调整松紧度，阻断侧支循环，通过观察大鼠右后肢趾端皮肤颜色及皮温，并与左侧对比来判断是否已阻断侧支循环，完全阻断动脉血供后，可见趾端皮肤青紫，发凉。4h后松解橡皮带，取出动脉夹，在手术显微镜下检查血管是否恢复通畅，以确认恢复右下肢血流灌注。假手术组仅单纯游离腹主动脉，不阻断，缝合皮肤。

治疗组造模后第二天开始以嘎狗噜全草水煎液灌胃，假手术组与模型组术后连续等剂量生理盐水灌胃，1天1次，共5天。第6天三组动物麻醉后，心尖取血，实验检测。

2.2 凝血功能检测大鼠心尖采血1.8mL置于含有3.8%构椽酸钠真空采血管中，及时采用ACLTOP 300CTS全自动血凝分析仪检测凝血功能：凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（Fib）、血浆凝血酶时间（TT）。

2.3 血清乳酸脱氢酶（LDH）及血清肌酐（Cr）检测大鼠心尖采血4mL入促凝管（促凝剂+分离胶），静置30min待血清部分析出后，予离心机离心，3000rpm，10min。分离血清后采用Beckman Coulter Au 5800型全自动生化分析仪测定血清LDH和Cr值。

3 结果

3.1 各组大鼠血清LDH、Cr含量比较与假手术组比较，模型组LDH、Cr含量均明显升高（P＜0.05，P＜0.01），说明造模成功。与模型组比较，治疗组血清LDH、Cr明显降低（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

表1 各组大鼠血清LDH、Cr含量比较（）

表1 各组大鼠血清LDH、Cr含量比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；LDH：乳酸脱氢酶；Cr：血清肌酐

组别假手术组模型组治疗组鼠数10 10 10 LDH（U/L）526.50±182.33 791.10±213.68** 573.90±142.37△Cr（μmol/L）26.85±4.09 32.44±6.47* 24.34±5.92△△

3.2 各组大鼠凝血功能比较与假手术组比较，模型组PT和APTT明显缩短（P＜0.05），Fib含量增加（P＜0.05），TT变化不显著（P＞0.05）。与模型组比较，治疗组PT和APTT延长（P＜0.01），Fib含量无明显差异，TT缩短（P＜0.01）。治疗组各项指标与假手术组差异不明显（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠凝血功能比较（）

表2 各组大鼠凝血功能比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，与模型组比较，△△P＜0.01；PT：凝血酶原时间，APTT：活化部分凝血活酶时间；FIB：纤维蛋白原；TT：血浆凝血酶时间。

组别假手术组模型组治疗组鼠数10 10 10 PT（s）9.89±0.72 9.03±0.74* 10.15±0.78△△APTT（s）24.24±5.41 20.45±1.70* 25.36±2.08△△Fib（g/L）1.67±0.22 1.86±0.17* 1.70±0.39 TT（s）22.97±4.32 24.94±2.41 20.65±3.03△△

4 讨论

嘎狗噜（melastoma dodecandrum），又名地稔或地菍，属野牡丹科（melastomaceae），其根及全株入药，分布于长江以南各省区，临床用于治疗高热、肿痛、咽喉肿痛、牙痛、赤白血痢疾、黄疸、水肿、痛经、崩漏、带下、疔疮、毒蛇咬伤等病症[3]，亦有学者研究发现，嘎狗噜具有明显的镇痛抗炎作用[4]。临床研究证明，嘎狗噜含有多糖、黄酮类、氨基酸、酚类、常量和微量元素、色素等多种化学成分[5-6]，具有活血止血功能[7]，其所含的多糖和黄酮成分具有清除氧自由基、抑制人红细胞膜和肝线粒体脂质过氧化作用[8-9]。

生理性止血过程主要包括血管收缩、血小板血栓形成和血液凝固三个过程，凝血系统的启动推动着血液凝固。内外源性凝血因子按照一定的顺序相继激活生成凝血酶，使可溶性的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白，纤维蛋白交织成网，最后形成血凝块，促进凝血。而血凝块的溶解又主要依赖于纤维蛋白溶解系统（纤溶系统），当纤溶系统活动亢进时，则导致凝血不彻底，有再出血的可能；纤溶系统低下，又易引起血液高凝，进而发生血栓性疾病。正常情况下，凝血和纤溶之间保持动态平衡。肢体缺血再灌注损伤会触发多系统、多途径参与的全身炎性反应综合征（SIRS）[10]，造成代谢障碍及凝血功能障碍，同时伴发器官功能障碍或衰竭，严重者造成死亡。缺血再灌注后出现纤溶酶原激活剂活性下降，凝血酶原时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）缩短，提示肢体缺血再灌注对机体凝血和纤溶系统有显著的影响，造成血液高凝状态，同时抑制纤溶活性[11]。APTT和PT主要反映内、外源性凝血系统状况，本实验中，与假手术组比较，模型组大鼠APTT和PT均显著缩短，FIB含量上升（P＜0.05），提示缺血再灌注损伤引起大鼠的凝血因子的活性增高，血液呈高凝状态。而与模型组比较，治疗组大鼠APTT和PT均显著延长，TT缩短（P＜0.01），表明嘎狗噜水煎液能影响纤溶系统活性，改善血液高凝状态，且对内、外源性凝血功能都有影响。

骨骼肌细胞受到损伤时，细胞膜通透性增高，正常情况下位于细胞内的LDH释放到细胞外进入血液循环，引起血清LDH和Cr的增高[12]。本研究中，模型组大鼠LDH及Cr含量均显著高于假手术组（P＜0.05，P＜0.01），而接受嘎狗噜水煎液处理后，治疗组大鼠LDH及Cr含量明显下降（P＜0.05，P＜0.01），进一步提示嘎狗噜具有减轻炎症反应的作用，可能与其具有抗氧化、清除氧自由基的机制有关。

［1］SkyschallyA，Schulz R，Heusch G.Pathophysiology of myocardial infarction:Protection by ischemic pre-and postconditioning［J］.Herz，2008，33（2）：88-100.

［2］雷后兴，李水福，郑宋明，等中国畲族医药学［M］.北京:中国中医药出版社，2007:302

［3］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：628.

［4］雷后兴，鄢连和，李水福，等.畲药地稔水煎液的镇痛抗炎作用研究［J］.中国民族医药杂志，2008，3（3）：45-47.

［5］翟小玲，倪健，谷雨龙.大孔吸附树脂分离地菍总酚的研究［J］.中草药，2008，39（2）：196.

［6］张超，陈志成，姚惠珍.地菍水溶性多糖MD1的分离纯化及组成分析［J］.广州医学院学报，2002，30（2）：21.

［7］周添浓.地稔注射液对家兔血液的影响［J］.广州中医学院学报，1995，12（1）：40.

［8］张超，姚惠珍，徐兰琴.地菍多糖MD1清除活性氧自由基及对人红细胞膜脂质过氧化作用影响的研究［J］.广州医学院学报，2002，30（4）：18.

［9］张超，张婷，姚慧珍，等.地菍总黄酮体外抗小鼠肝线粒体脂质过氧化作用的研究［J］.中医药学刊，2005，23（9）：1680.

［10］Thorey F，Stukenborg-Colsman C，Windhagen H，et al.The effect of tourniquet release timing on perioperative blood loss in simultaneous bilateral cemented total knee arthroplasty：a prospective randominzed study［J］.Technol Health Care，2008，16（2）：85-92.

［11］陈雷，沈斌，金可可，等.肢体缺血再灌注家兔凝血和纤溶系统的变化及葛根素的干预［J］.中医药学刊2006，24（6）：1040-1042.

［12］张彦荣，吴文新，张峰，等.缺血后处理对大鼠后肢肌肉缺血再灌注损伤作用的实验研究［J］.疑难病杂志，2010，9（12）：894-896.

（收稿：2016-09-07修回：2016-12-28）

Biological Effects of Melastoma Dodecandrum Lour on Coagulation Function in Rats with Limb Ischemia-reperfusion Injury

WANG Jiwei1,ZHANG Ning1,LAN Jun1,XU Rongcheng2,DENG LianCheng1,CHEN Ke2, YAN Lianhe3,LEI Houxing3.1 Lishui People's Hospital，Lishui(323000),China;2 Wenzhou Medical University, Wenzhou(325035),China;3 Lishui Institute of She-national Medicince,Lishui(323000),China

Objective To study the biological effects of Melastoma dodecandrum Lour on coagulation function in rats after limb ischemia-reperfusion.Methods Thirty SD rats were randomly divided into sham group,control group, and Melastoma dodecandrum Lour group.Model of limb ischemia reperfusion injury was made by using the method of blocking blood flow femoral artery of rats in control group and Melastoma dodecandrum Lour group.Prothrombin time（PT）,activated partial thromboplastin time（APTT）,fibrinogen（Fib）,thrombin time（TT）,serum lactate dehydro genase（LDH）and creatinine（Cr）in blood of rats in each group were detected.Results Compared with sham group,PT and APTT in model group were shortened respectively（9.03±0.74s vs 9.89±0.72s;20.45±1.70s vs 24.24± 5.41s,P＜0.05）,Fib increased（1.86±0.17g/L vs 1.67±0.22g/L,P＜0.05）,but TT was not significantly different（P＞0.05）;model group had also higher LDH（791.10±213.6U/L vs 526.50±182.33U/L,P＜0.01)and Cr（32.44±6.47μmol/ L vs 26.85±4.09μmol/L,P＜0.05）.Melastoma dodecandrum Lour prolonged PT（10.15±0.78s）and APTT（25.36± 2.08s）in rats with ischemia reperfusion injury（P＜0.01）,reduced TT（20.65±3.03s vs 24.94±2.41s,P＜0.01）and LDH（573.90±142.37U/L,P＜0.01）and Cr（24.34±5.92μmol/L,P＜0.05）,but did not affect Fib（P＞0.05）.Conclusion Melastoma dodecandrum Lour can effectively reduce the degree of injury in rats with limb ischemia/reperfusion injury through improving blood coagulation/fibrinolysis function and the environment of metabolism.

rats;ischemia-reperfusion；coagulation function；Melastoma dodecandrum Lour

浙江省丽水市重点创新团队项目（No.2012CXTD09-06）

1浙江省丽水市人民医院创伤骨科（王济纬、兰俊）、重症医学科（张宁）、药剂科（邓连成）（丽水323000）；2温州医科大学（温州325035）；3浙江省丽水市畲族医药研究所（丽水323000）

雷后兴，E-mail：zjleihx@163.com